T4 DNA连接酶：克隆、文库构建与基因合成的关键工具

T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase）是一种来源于 T4噬菌体 的酶，能催化DNA分子中相邻的 5'-磷酸基团（5'-P） 和 3'-羟基（3'-OH） 之间形成磷酸二酯键，实现DNA片段的共价连接。它是分子生物学中常用的工具酶之一。

1.反应条件

底物：双链DNA中的切口（nick）、粘性末端或平末端。

辅因子：需要 ATP（腺苷三磷酸） 作为能量来源。

最适温度：16–25°C（但平末端连接通常在低温下进行以提高效率）。

缓冲液：含Mg²⁺的缓冲体系（如Tris-HCl、DTT等）。

2. 功能特点

高效连接粘性末端（互补突出端）。

可连接平末端（但效率较低，需更高酶量或PEG优化）。

修复DNA链中的单链切口（如PCR产物或限制酶切后的缺口）。

3.应用

a. 分子克隆

载体与插入片段连接：将外源DNA片段（如PCR产物）插入质粒载体，用于转化和扩增。

无缝克隆（Gibson Assembly替代方案）：通过优化反应条件实现多片段组装。

b. 文库构建

NGS文库制备：连接测序接头（adapters）到DNA片段两端。

cDNA文库构建：连接双链cDNA与载体。

c. 突变修复与合成生物学

定点突变：连接突变引物扩增的DNA片段。

基因合成：组装寡核苷酸片段为完整基因。

d. 其他应用

荧光标记探针制备：连接荧光标记的核苷酸。

DNA损伤修复研究：模拟细胞内DNA连接过程。

T4 DNA连接酶因其高效性和广泛适用性，已成为基因工程和DNA研究的核心工具之一。