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摘 要］ 目的：研究氧化高密度脂蛋白（oxHDL）对单核细胞膜脂流动性及淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）表达的影响。方法：采用荧光探针DPH检测膜脂流动性，用流式细胞术间接免疫荧光法检测人单核细胞株THP-1细胞表面LFA-1的表达水平。结果：100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL（氧化低密度脂蛋白）作用20 h后可显著降低THP-1细胞膜脂流动性（LFU），分别较对照组低45%和52%（P＜0.01）；oxHDL作用24 h可明显促进LFA-1的表达，阳性细胞率和平均荧光强度分别较对照组高39%和45%（P＜0.01）。结论：oxHDL可能通过促进单核细胞表达LFA-1而使更多的单核细胞粘附于内皮，它还可降低单核细胞膜脂流动性，这将使单核细胞在进入内皮下层后难于重新返回循环血中，从而促进动脉粥样硬化的发生。
Effects of oxidized high-density lipoprotein on membrane fluidity
and the expression of lymphocyte function associated antigen-1 of monocyte
HU Hou-yuan, CHEN Yun-zhen
（Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）
［Abstract］ AIM: To investigate the effects of oxidized high-density lipoprotein （oxHDL） on membrane fluidity and the expression of lymphocyte function associated antigen（LFA-1） of monocyte. METHODS: The membrane fluidity of THP-1 cells was assayed by fluorescence anisotropy with DPH （1,6-dipheny-1,3,5-hexatriene）, a fluorescent probe; The LFA-1 expression on THP-1 cells were assayed by flow cytometry with indirect immunofluorescence.RESULTS: The membrane fluidity of THP-1 cells was reduced by 45% and 52% respectively （P＜0.01） after incubation with 100 μg protein/mL oxHDL and oxLDL for 20 h; oxHDL could stimulated the expression of LFA-1 on THP-1 cells, the positive cell rate and mean fluoresence intensity （MFI） increased by 39% and 45% respectively versus control group （P＜0.01） after incubation with cells for 24 h. CONCLUSIONS: By increasing the expression of LFA-1 on monocyte, oxHDL can promote the monocyte-endothelium adhesion; oxHDL also can reduce the membrane fluidity of monocyte, that will limit the returning of monocytes from subendothelium back to the circulation. This suggested that oxHDL may play an important role in atherogenesis.
［MeSH］ Lipoproteins, HDL; Monocytes; Membrane fluidity; Lymphocyte function-associated antigen-1
近年研究表明，高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）也易被氧化修饰而形成氧化高密度脂蛋白（oxidized high density lipoprotein, oxHDL）,oxHDL不仅转运胆固醇的能力下降，而且具有细胞毒性作用，还可刺激内皮细胞释放内皮素-1，并可被清道夫受体识别和摄取，从而有可能促进动脉粥样硬化的发生［1～4］。本文进一步研究oxHDL对人单核细胞株THP-1细胞膜脂流动性及淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1）表达的影响，以深入探讨oxHDL在动脉粥样硬化早期发生中的作用。
材 料 和 方 法
一、细胞培养
THP-1细胞由*上海细胞生物学研究所细胞库提供。采用含10%小牛血清的RPMI 1640*培养基（含L-谷氨酰胺2 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、青链霉素各100 U/mL），37℃、5%CO2孵箱中培养。实验均采用复苏后传至第5代以上的细胞。
二、脂蛋白的分离和氧化修饰
采用一次性密度梯度超速离心法分离人血浆HDL（包括HDL2和HDL3）和LDL，氧化修饰采用Cu2＋介导法［1］，每0.5 mg protein/mL的HDL和LDL分别与10和15 μmol/L的CuSO4于37℃、5% CO2潮湿孵箱中共同孵育24 h，然后以20倍体积的10 mmol/L PBS（pH 7.4）透析24 h以上，每8 h换液1次，以去除Cu2＋和可溶性的过氧化产物。硫代*酸反应产物荧光检测法测定HDL氧化前后丙二醛的含量分别为0.18和8.14 nmol/mg protein, LDL氧化前后丙二醛的含量分别为2.10和14.35 nmol/mg protein。
三、试剂
DPH（1，6-二苯基-1，3，5-己三烯；1，6-dipheny-1,3,5-hexatriene）为Fluka公司产品；小鼠抗人LFA-1单克隆抗体为DAKO公司产品；FITC—羊抗鼠IgG抗体（GAM-FITC Ab）购自北京中山公司。
四、膜脂流动性的检测［5］
用含5%小牛血清的RPMI 1640*培养基调THP-1细胞至1×106／mL，接种于24孔板中（1 mL/孔），加入终浓度为100 μg蛋白/mL的脂蛋白（HDL、oxHDL、LDL和oxLDL），对照组加入等体积的PBS，每组设2个复孔，实验重复3次。20 h后收集细胞，用含钙镁的PBS液洗2次，调细胞密度为1×106/mL；另取一塑料试管，加入PBS 1 mL和20 mmol/L DPH（四氢呋喃配制）5 μL，充分振荡5 min，再加入1 mL细胞悬液，轻轻摇匀，DPH终浓度为50 μmol/L，置25℃水浴30 min，PBS洗两次，低速离心10 min，溶于1.5 mL PBS中，室温下测荧光强度（I），激发波长360 nm，发射波长430 nm，狭缝10 nm。按下列公式计算偏振度（P）、微粘度（η）和膜脂流动性（LFU）：
P=（Ivv-gIvh）/（Ivv+gIvh）
其中g为校正因子，按下式计算：g=Ihv/Ihh；P为偏振度，I为荧光强度；v代表垂直方向，h代表水平方向，I的一对限定因素中，*个为起偏器光轴的方向，第二个为检偏器光轴的方向。
η=2P/（0.46-P）
式中的η为微粘度，0.46为常数。
LFU=［（Pzui大值/Pr）-1］÷Pr
式中LFU为膜脂流动性，Pzui大值为0.5，Pr为P的实测值。
五、LFA-1表达的检测
THP-1细胞以含10%小牛血清的RPMI 1640*培养基调至1×106/mL，接种于24孔板中（1 mL/孔），分为对照组（加入等体积的PBS）、HDL组和oxHDL组，脂蛋白作用时间为24 h，实验重复4次。采用流式细胞术间接免疫荧光法检测LFA-1的表达，主要步骤如下：取5×105细胞，用冷PBA（10 mmol/L PBS，含0.1%BSA，0.1%NaN3，pH7.4）清洗两遍，弃上清，加入以PBA 1∶100稀释的单克隆抗体100 μL（背景对照组只加不含单抗的PBA），轻轻吹打混匀，4℃放置30 min，PBA洗2次，再加入以1∶15稀释的GAM-FITC Ab 100 μL，轻轻吹打混匀，4℃ 30 min，离心弃上清，用冷PBA洗3次，zui后用0.5 mL PBS悬起细胞，用FACStar-PLUS流式细胞仪检测，以背景对照为基础计算阳性细胞率（%）和平均荧光强度（MFI）。
五、统计处理
数据均以均数±标准差（ ±s）表示，差异显著性以t检验判定。
结 果
一、oxHDL和oxLDL对THP-1细胞膜脂流动性的影响
oxHDL和oxLDL可明显降低THP-1细胞的膜脂流动性（LFU），100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL作用20 h后THP-1细胞的LFU分别较对照组低45%和52%（P＜0.01）；而HDL和LDL对膜脂流动性无明显影响（见表1）。
表1 HDLs和LDLs对THP-1细胞膜脂流动性的影响
Tab 1 Effexts of HDLs and LDLs on membrane lipid fluidity of THP-1 cells （ ±s,n=6）
| | Control | HDL | oxHDL | LDL | oxLDL |
| P | 0.145±0.021 | 0.155±0.019 | 0.180±0.009*＃ | 0.151±0.029 | 0.191±0.010* *＃＃ |
| η | 0.928±0.188 | 1.012±0.176 | 1.287±0.045*＃ | 0.992±0.285 | 1.433±0.121* *＃＃ |
| LFU | 17.970±6.140 | 15.170±4.940 | 9.930±0.690*＃ | 16.920±6.470 | 8.570±0.820*＃ |
*P＜0.05, * * P＜0.01， vs control group; ＃ P＜0.05, ＃＃ P＜0.01， vs unmodified group of each 二、oxHDL对THP-1细胞LFA-1表达的影响
oxHDL可明显促进THP-1细胞LFA-1的表达， 100 μg protein/mL的oxHDL作用24 h后其LFA-1的阳性细胞率和平均荧光强度分别较对照组高39%和45%（P＜0.01）；而HDL无此作用（见表2）。
表2 HDLs对THP-1细胞LFA-1表达的阳性细胞率
和平均荧光强度的影响
Tab 2 Positive rate and MFI of LFA-1 on THP-1 cells in
response to HDLs （ ±s,n=4）
| | Control | HDL | oxHDL | |
| % | 43.3±3.7 | 45.2±4.5 | 60.1±2.5* *＃＃ | |
| MFI | 132.8±18.7 | 138.3±20.5 | 191.5±17.6* *＃＃ | |
* *P＜0.01，vs control group; ＃＃ P＜0.01， vs HDL group; mFI: mean fluoresence intensity讨 论
THP-1细胞是一种人单核细胞株，建株于一急性单核细胞白血病患儿，具备人单核细胞绝大多数的生物学功能和生化功能特征。与人单核细胞相比，THP-1细胞更容易获得、并能传代培养，经佛波酯刺激后可转变为巨噬细胞，吞噬脂质后可进一步演变成泡沫细胞，因此被广泛用于有关动脉粥样硬化方面的研究［6］。
本研究进一步探讨了oxHDL对动脉粥样硬化发生中的重要细胞成分—单核细胞—的作用。结果发现，oxHDL和oxLDL可降低THP-1细胞的膜脂流动性（LFU），与对照组相比分别低45%和53%，而HDL和LDL对膜脂流动性无明显影响。已有研究表明，oxLDL可降低内皮细胞膜脂流动性，其机制可能为：①氧化脂蛋白可被细胞膜上的受体摄取，从而使细胞膜中胆固醇酯的含量增加；②氧化脂蛋白导致的细胞内钙浓度增加，可使膜收缩蛋白发生交联［7，8］。氧化脂蛋白使单核细胞膜脂流动性的降低，将使单核细胞在进入内膜后更难于返回循环血中，从而使更多的单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞转化。
LFA-1主要位于白细胞的表面，是细胞间粘附分子ICAM-1和ICAM-2的受体，在单核细胞与内皮细胞的粘附中发挥重要作用。本研究表明oxHDL可明显促进THP-1细胞LFA-1的表达，流式细胞仪检测显示oxHDL作用24 h后其阳性细胞率和平均荧光强度分别较对照组高39%和45%，而HDL无此作用。
本研究表明，oxHDL可通过促进单核细胞表达LFA-1而使更多的单核细胞粘附于内皮，它还可降低单核细胞膜脂流动性，这将使单核细胞在进入内皮下层后难于重新返回循环血中，从而促进动脉粥样硬化的发生。本研究还提示，通过防止各种因素对脂蛋白的氧化将会在一定程度上预防动脉粥样硬化的发生。关于oxHDL的体内存在形式以及是否具有更广泛的致动脉粥样硬化作用尚有待进一步研究。
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