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抗甲状腺球蛋白抗体TGA的检测方法

来源:上海源叶生物科技有限公司   2012年07月14日 10:35  

甲亢、慢性甲状腺炎、甲减具有自身免疫病的性质。在这些疾病的患者中,常可测出循环抗甲状腺抗体,如抗甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulinantibodyTGA)、抗甲状腺微粒体抗体(thyromicrosomalantibodyTMA)、抗第二胶原抗体、抗甲状腺细胞膜抗体、甲状腺刺激抗体。前二者在临床实验中应用zui广,诊断价值也较大。

应用RIA检测TGA敏感性甚高,且现已有试剂盒供应,操作简便、快速,样品可直接测定。但由于条件所限,目前常用的还是IFF和ELISA法。在纯化TG的基础上,进行ELISA法则具有敏感、特异、快速、简便、可批量检测等优点。特介绍如下。

1.甲状腺球蛋白的纯化 将手术摘除的甲状腺洗净,—30℃冻存,取出后在冻结状态下用刀削成薄片,加2倍量生理盐水于4~C浸泡过夜(切勿搅拌)。收集浸液,同法再浸泡1次。将2次浸液合并,加硫酸铵使达37%饱和度,4℃静置1~2h,离心除去沉淀。上清内继续加硫酸铵使达42%饱和度,4~C静置2h,2000r/rain离心20rain,收集沉淀物,溶于0.01mol/L,pH7.2PBS中,即为粗提TG。将粗提TG用SephadexG-200柱作凝胶过滤,PBS洗脱,收集*蛋白峰,混合,即为纯化的TG。如疑残留有白蛋白,可再流穿抗人全血清-Sepharose4B亲和层析柱。

2.操作步骤 用纯化TG(10—50pg/mL)包被聚苯乙烯微孔板,每孔0.1mL,37~C1h后,4℃过夜;洗涤(每次3min,共3次,以下同)后加1:10稀释待测血清,每孔0.1mL,设复孔。37%,2h(或45cC,1h)后洗涤;每孔加HRP标记的TG(zui适工作浓度用方阵法滴定)0.ImL,37~C,2h(或45℃,1h)后洗涤;每孔加OPD-U202底物0,lmL,37~C避光反应15—20min显色后,加0.05mL2mol/LH2S04终止反应。目测呈色程度,或用酶标仪检测492nm吸光度,计算复孔均值。

3.结果观察 目测呈色深浅与标准品孔比较,判定是否为阳性。P/N值大于或等于2.1判为阳性。

4.临床意义 血清TGA是诊断甲状腺自身免疫疾病的一个特异性指标。大约60%甲亢,80%—90%慢性甲状腺炎患者TGA表现为强阳性。TGA阳性者倾向于诊断为慢性淋巴细胞性甲状腺炎,而较少考虑甲状腺肿瘤,故可作为甲状腺肿块的鉴别。

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