凝胶色谱仪如何解析蛋白纯度与聚集体

来源：上海杜凯生物科技有限公司 2025年04月16日 17:50

　　凝胶色谱仪（GPC/GFC）是蛋白质纯度分析与聚集体检测的核心工具，其核心原理基于分子筛效应：大分子因无法进入凝胶孔隙而快速流出，小分子则因深入孔隙而延迟洗脱，从而实现分子量依赖的分离。以下是具体解析方法：

　　一、蛋白纯度分析

　　分离机制

　　使用葡聚糖（Sephadex）或琼脂糖（Sepharose）填料构建凝胶柱，流动相为低离子强度缓冲液（如PBS）。

　　目标蛋白与杂质（如宿主细胞蛋白、核酸）因分子量差异被分离，纯蛋白在单一峰中洗脱，杂质形成肩峰或拖尾。

　　纯度评估

　　峰面积积分：通过紫外检测器（UV280nm）计算目标蛋白峰面积占比，纯度=目标峰面积/总面积×100%。

　　标准品对比：与已知纯度的蛋白标准品（如BSA）共跑，对比保留时间与峰形一致性。

　　二、聚集体检测

　　聚集体形成机制

　　蛋白质在储存、运输或高温条件下易发生二硫键交换、疏水相互作用，形成二聚体、寡聚体甚至可溶性聚集体。

　　检测方法

　　多角度光散射（MALS）联用：实时监测分子量变化，聚集体表现为保留时间提前且分子量显著增大（如单体50kDavs二聚体100kDa）。

　　峰形分析：聚集体导致峰形不对称（前延或拖尾），通过第二维分析（如SEC-MALS）可定量聚集体比例。

　　案例

　　某单抗药物在40℃储存后，凝胶色谱图显示主峰前出现肩峰，MALS检测到20%二聚体，证实高温导致聚集。

　　三、技术优化

　　柱效提升：使用小粒径填料（如3μm）提高分辨率，缩短分析时间至15分钟。

　　溶剂兼容性：选择pH耐受范围广的凝胶（如Superdex200Increase），避免蛋白变性。

　　自动化：结合液相色谱系统（如AKTA），实现梯度洗脱与在线浓度监测。

　　凝胶色谱仪通过分子量依赖的分离机制，可直观解析蛋白纯度与聚集体水平，为生物制药质量控制提供关键数据支持。

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