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生殖器疱疹患者单一核细胞分泌肿瘤坏死因子α、 白介素6和HLA－Ⅱ类抗原表达的研究
生殖器疱疹（GH）随着性病发病率上升而增多，其病原体单纯疱疹病毒2（HSV－2）与某些生殖器恶性肿瘤密切相关[1]。在抗HSV感染中，细胞免疫起着重要作用，我们研究了生殖器疱疹患者外周血单一核细胞分泌白介素6（IL－6）、肿瘤坏死因子α（TNF－α）水平及人白细胞Ⅱ类抗原（HLA－Ⅱ类抗原）表达的改变，探讨生殖器疱疹发病的免疫学机制。
一、材料与方法
（一）研究对象：
1.诊断指标：①在生殖器部位发现典型簇集性小水疱或有簇集性点状糜烂结痂者，或既往有反复发生的生殖器疱疹史。②血清抗HSV－2IgG阳性。③排除其它疾病如梅毒、白塞病、非性病生殖器溃疡等。
2.临床资料：患者符合诊断指标者27例,男21例,女6例,年龄21～48岁。病程在1个月以内者6例，半年至1年者12例，1年以上者9例。初发5例,发作次数2～5次11例，6～10次6例，10次以上5例。发生于冠状沟6例，包皮处10例，阴茎处6例，龟头处4例，女阴6例。簇集性水疱者11例，点状糜烂结痂者21例。发作前有明显诱因2例，无诱因25例。发作时伴有痒感5例，伴有疼痛8例，伴有烧灼感5例，无明显自觉症状10例。所有患者近期均未接受过免疫治疗，且无自身免疫性及其他感染性疾病。对照组为健康献血员20例，年龄、性别与患者组相近。
（二）方法：
1.单一核细胞分离：抽取静脉血，肝素抗凝，经Ficoll－Hypaque密度梯度离心法，分离获得单一核细胞，用*RPMI1640培养液（含10％小牛血清，青、链霉素各100U/mL）调细胞为2×106/mL，将上述细胞悬液加入有盖玻片12孔培养板中,每孔1mL，体积分数为5％CO2、37℃培养箱粘附3h，取出盖玻片，用预温D－Hanks液轻轻洗2次，风干,纯丙酮固定4～5min，－20℃保存待测。
2.单一核细胞培养:将2×106/mL细胞悬液加入到培养瓶中，体积分数为5％CO2、37℃培养箱中粘附3h，弃去非粘附细胞，用预温D－Hanks液洗细胞2次,加入含脂多糖1μg/mL的*RPMI1640培养液，体积分数为5％CO2、37℃培养箱培养48h，1500r/min离心10min，收集上清液，－20℃保存待测。
3.双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）检测上清液中TNF－α、IL－6含量，非标记抗体桥联酶标记技术（APAAP法）检测HLA－Ⅱ类抗原表达率。TNF－α，IL－6ELISA试剂盒，APAAP试剂盒由北京邦定生物医学公司提供。
（三）统计学处理:两组间均数比较t检验。
1.诊断指标：①在生殖器部位发现典型簇集性小水疱或有簇集性点状糜烂结痂者，或既往有反复发生的生殖器疱疹史。②血清抗HSV－2IgG阳性。③排除其它疾病如梅毒、白塞病、非性病生殖器溃疡等。
2.临床资料：患者符合诊断指标者27例,男21例,女6例,年龄21～48岁。病程在1个月以内者6例，半年至1年者12例，1年以上者9例。初发5例,发作次数2～5次11例，6～10次6例，10次以上5例。发生于冠状沟6例，包皮处10例，阴茎处6例，龟头处4例，女阴6例。簇集性水疱者11例，点状糜烂结痂者21例。发作前有明显诱因2例，无诱因25例。发作时伴有痒感5例，伴有疼痛8例，伴有烧灼感5例，无明显自觉症状10例。所有患者近期均未接受过免疫治疗，且无自身免疫性及其他感染性疾病。对照组为健康献血员20例，年龄、性别与患者组相近。
（二）方法：
1.单一核细胞分离：抽取静脉血，肝素抗凝，经Ficoll－Hypaque密度梯度离心法，分离获得单一核细胞，用*RPMI1640培养液（含10％小牛血清，青、链霉素各100U/mL）调细胞为2×106/mL，将上述细胞悬液加入有盖玻片12孔培养板中,每孔1mL，体积分数为5％CO2、37℃培养箱粘附3h，取出盖玻片，用预温D－Hanks液轻轻洗2次，风干,纯丙酮固定4～5min，－20℃保存待测。
2.单一核细胞培养:将2×106/mL细胞悬液加入到培养瓶中，体积分数为5％CO2、37℃培养箱中粘附3h，弃去非粘附细胞，用预温D－Hanks液洗细胞2次,加入含脂多糖1μg/mL的*RPMI1640培养液，体积分数为5％CO2、37℃培养箱培养48h，1500r/min离心10min，收集上清液，－20℃保存待测。
3.双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）检测上清液中TNF－α、IL－6含量，非标记抗体桥联酶标记技术（APAAP法）检测HLA－Ⅱ类抗原表达率。TNF－α，IL－6ELISA试剂盒，APAAP试剂盒由北京邦定生物医学公司提供。
（三）统计学处理:两组间均数比较t检验。
表1 生殖器疱疹患者单一核细胞分泌细胞因子水平和HLA-I类抗原表达水平的改变（ ±s）
| 组别 | 例数 | TNF-A（ng/mL） | IL-6（ng/mL） | HLA -DQ（%） | HLA -DR （%） |
| 对照组 | 20 | 4.68±0.54 | 6.46±1.94 | 37.63±1.79 | 81.03±1.32 |
| 患者组 | 27 | 3.13±0.44 | 3.32±1.06 | 29.54±1.5 | 67.48±1.51 |
| t值 | | 2.24 | 4.01 | 4.09 | 6.23 |
| P值 | | <0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.01 |
| 二、结果 经脂多糖刺激后，生殖器疱疹患者外周血单一核细胞培养上清液中TNF－α、IL－6水平均低于对照组，差异有显著性（P均<0.05）；生殖器疱疹患者外周血单一核细胞HLA－DR、HLA－DQ抗原表达率也均低于对照组，差异有显著性（P均<0.01），见表1。 三、讨论 TNF－α、IL－6均是机体内作用广泛的细胞因子，在脂多糖作用下主要由活化的单核／巨噬细胞产生，适量的TNF－α能杀伤病毒感染细胞，具有抗病毒作用，它也可刺激皮肤成纤维细胞诱导IL－1、IL－6、干扰素－β的合成，增进白细胞的趋化性，发挥抗病毒介质作用。IL－6具有调节B细胞增殖分化，辅助T细胞增生活化，抗病毒等生物学效应。研究证明[2]，多种病毒如HIV、HSV及流感病毒等可使宿主细胞合成和分泌细胞因子能力发生改变，从而影响病毒性疾病的发生、发展及转归。本实验研究发现，生殖器疱疹患者单一核细胞在LPS刺激下分泌TNF－α、IL－6水平较正常对照组明显降低，TNF－α、IL－6水平低下。 本实验研究发现，生殖器疱疹患者单一核细胞HLA－Ⅱ类抗原表达明显降低，导致单一核细胞抗原呈递能力下降，其功能受抑或降低，不能有效地杀伤靶细胞，从而使病毒得以生长繁殖。 |
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