Flipper TR膜张力传感器光物理特性和作用机制分析

Flipper-TR是一种荧光探针，能够特异性靶向细胞的质膜，并通过其荧光寿命的变化报告膜张力的变化。它是Flipper探针家族中先进的成员（参见文献2和3），通过机械感受基团中两个扭曲的二噻吩并噻吩之间的扭转角度和偏振的变化来感知脂质双层膜的组织变化。Flipper-TR能够自发地插入细胞的质膜中，并且只有在插入脂质膜时才会发出荧光。它具有宽吸收和发射光谱，通常可以用488 nm激光进行激发，而发射光则在575至625 nm之间收集。Flipper-TR适用于多种生物体，包括细菌、酵母、哺乳动物和植物。

艾美捷Flipper TR膜张力传感器（CY-SC020）光物理特性：

- 吸收波长（λabs）：480 nm

- 发射波长（λem）：600 nm

- 大摩尔吸光系数（εmax）：1.66×10⁴ mol⁻¹·cm⁻¹（DMSO中）

- 荧光寿命：2.8 - 7 ns

- 量子产率（QY）：30%（乙酸乙酯中）

Flipper TR膜张力传感器的作用机制示意图：

图：左侧为Flipper-TR分子的示意图。中间为低张力脂质双层，其中Flipper呈扭曲状态；右侧为探针呈平面状态。

储存与操作：

收到后将探针储存于-20°C。使用新鲜且无水的DMSO配制探针溶液（因为陈旧和含水的DMSO会显著缩短探针的保质期）。使用后将探针溶液储存于-20°C。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，溶液中的探针应可在3个月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的HeLa细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的优标记条件应通过实验确定。

1. 配制1 mM储备液：将Flipper-TR小瓶的内容物溶解在50 µL无水DMSO中，制备1 mM储备液。该溶液应储存于-20°C或更低温度。不要将溶液分装成小份，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液应可在三个月内保持稳定。（可选）如果需要准确测定储备液的浓度，可将1 µL 1 mM储备液稀释在99 µL DMSO中。在425 nm处测量吸光度。使用上述给定的消光系数计算浓度。

2. 配制染色液：在应用于细胞之前，将Flipper-TR稀释至所需浓度（从1 µM开始）的细胞培养基中（不要在使用前保存染色液超过2小时）。注意：当使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的细胞培养基时，与不含血清的培养基相比，标记效率可能会降低。如果观察到信号较低，可以将探针浓度增加至2 µM。

3. 细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育15分钟，然后进行成像。30分钟或更长时间后，由于膜的周转，可能会观察到内质网结构的标记。然而，其他含有膜的细胞器（内质网、高尔基体）的标记是有限的。内质网结构通常具有较短的寿命。可选地，可以移除含有探针的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞一次。由于探针仅在膜中具有荧光，因此不需要移除探针，特别是在计划进行长期成像（>24小时）且培养基中含有血清的情况下。在低于1 µM的探针浓度下，与探针孵育2-3天后未观察到对细胞活力的影响

4. FLIM成像：使用标准的FLIM显微镜对细胞进行成像，使用485 nm或488 nm脉冲激光进行激发，并通过600/50 nm带通滤光片收集光子。我们建议优化标记程序以及图像采集设置，以尽量减少488 nm激发光对活样本的光损伤。为了提取寿命信息，将感兴趣区域（ROI）或单像素（积累足够计数以确保良好统计）的光子直方图拟合为双指数，并提取两个衰减时间τ₁和τ₂。具有较高拟合振幅的长寿命τ₁用于报告膜张力，其值在2.8至7.0 ns之间。寿命越长，膜的张力越大。τ₂的值较小（在0.5至2 ns之间），且拟合振幅较小，不太适合用于研究膜张力。可以使用参考文献1中给出的校准程序将寿命与绝对膜张力相关联。

重要注意事项：

- 只能通过FLIM显微镜进行膜张力测量，荧光强度或波长不能可靠地报告膜张力。

- 随时间变化脂质组成的系统也可能导致Flipper-TR寿命的变化。

- FLIM成像是一种高级显微镜技术，需要配备适当的激发激光器、光子计数系统和发射滤光片的商业或定制FLIM显微镜系统。建议客户咨询其仪器负责人或联系显微镜制造商，以确保其系统能够成像Flipper-TR的荧光和寿命。

文献参考：

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.