总氧自由基清除能力(ORAC)测试试剂盒说明书

一、 测定原理

ORAC 法(oxygen radical absorbance capacity，氧自由基吸收能力)是由 Cao 等在 Glazer  研究的基础上发展起来的抗氧化能力的测定方法。它具有生物相关性强，可以通过改变自由 基和反应体系的溶剂测定脂溶性和水溶性物质的抗氧化活性，方法的专一性强等优点(赵建 等，2011)，因而近年在研究领域广泛应用。

该方法以偶氮类化合物作为自由基来源，荧光素钠作为指示剂，水溶性维生素 E（Trolox） 为标准物质进行抗氧化分析。氧自由基通过氢原子转移（HAT）过程使荧光探针氧化，并随 着时间的推移淬灭荧光探针(Huang et al., 2015)。分析中存在的抗氧化剂可阻止荧光探针氧化， 推迟荧光的猝灭，直至样品中的抗氧化剂活性耗尽。因此可以通过荧光衰减的曲线来计算抗 氧化物质的氧自由基清除能力：样品的氧自由基清除能力越强，荧光素钠的淬灭越慢，则荧 光强度曲线下面积(AUC)越大。

二、 试剂及耗材组成

稀释液：100 mL×1 瓶

试剂一：荧光素钠 100μL ×1 支

试剂二：自由基引发剂 粉剂 ×1 支

阳性对照：1mM Trolox 标准溶液 1mL×1 支（乙醇配制）

黑色荧光酶标板 ×1 片

试剂一配制瓶 ×1 个

加样槽 ×1 个

三、 储存条件及有效期

-20℃可保存 6 个月。

四、 试剂的配制

试剂一应用液：将试剂一小心转入 10mL 稀释液中，采用试剂一配制瓶配制，现配现用。

试剂二应用液：在试剂二瓶内加入 15mL 稀释液，冰上配制，现配现用。

Trolox 标准溶液：首先将 1mM Trolox 标准溶液使用稀释液¹按照 1：25 稀释成 40μM 溶液(最终体系为 200μL，样品/trolox 添加量为 50μL，因此 40μM trolox 的体系终浓度为 10μM)。

稀释方法：取 1mM Trolox 标准溶液 400μL，加入 9.6mL 稀释液，充分摇匀，得到终浓 度为 10μM Trolox 溶液 10mL（实际浓度为 40μM）。

按照下表稀释得到不同浓度的 Trolox 标准溶液²：

¹ 稀释液一般应该与样品稀释液保持一致，水溶性样品可直接采用本试剂盒提供的稀释液， 脂溶性样品需自备稀释液；

² 标准曲线不是必需步骤，但是推荐制作。表中给出的浓度为建议值，您也可以根据自己样 品的抗氧化能力适当调整标准曲线范围。

五、 操作步骤

直接在黑色荧光酶标板按照下表加样：

充分混匀，37℃避光静置

充分混匀²，立即采用酶标仪进行测定，酶标仪设定参数如下：

振荡时间：5s（可选） 

孵育温度：37℃； 

激发波长：485±20nm； 

发射波长：520±20nm； 

读取方式³：1-5min 读取 1 次，连续读取 60 - 90 min 

¹迅速加入，建议使用多道移液器快速加入； 

² 如酶标仪具备振荡功能，建议使用酶标仪振荡以节约时间； 

³ 至少反应 60min，2min 读取一次数据；也可将读取时间延长至 90min。

六、计算方法

1.计算曲线下面积(AUC) 

将读取得到的初始荧光值(即开始检测后第一次读取的荧光值)记为 F0，第 n 次检测读取 得到的荧光值记为 Fn，则采用微积分的思路，AUC 可由如下公式计算： 

AUC = F0/F0 + F1/F0 + F2/F0 + …… + Fn/F0 

2. 计算净曲线下面积（netAUC） 

如下图所示，首先如上述计算不加任何抗氧化剂的孔（空白）的 AUC，得到空白 AUC （AUCblank），将样品（标准品）AUCsample 值减去 AUCblank，即为净曲线下面积（netAUC）。 

netAUC = AUCsample –AUCblank 

3. 制作标准曲线 

将各浓度 Trolox 计算得到的 netAUC 线性拟合成为标准曲线。 

例如：计算得到 netAUC 和标准曲线如下： 

4. 通过标准曲线计算样品等价的 Trolox 当量 

如计算得到样品溶液 netAUC 值为 6.66，根据标准曲线计算可知，该样品溶液与 0.57 μM  TE 的 netAUC 相等，则该样本溶液 ORAC 值为 0.57 μM TE (Trolox equivalent) . 如已知样本溶液的浓度为 100 μg/mL，则可进一步计算该样品的 Trolox 当量为 5.7 μmol TE/g。

七、注意事项

1. 本试验需要使用到具有荧光功能的酶标仪，建议使用同时具备荧光测定、孵育、振摇和 酶促动力学读取功能的酶标仪。请在试验前确定实验室具备此测定条件，且在试验前先行了 解测试程序的设置；

2. 请事先准备好多道移液器（排枪）；

3. 建议先将样品梯度稀释后进行预试验，不在标准曲线的线性范围内会造成较大误差；

4. 试剂二应用液建议在加入试剂一应用液后的等待时间内配制，以尽可能现配现用。同时， 试剂二请务必迅速加入，尽可能保证各孔加样时间一致，以减小系统误差(Mellado-Ortega et al., 2017)。

5. netAUC 可不计算，只是标准曲线不过原点，但不影响结果准确性。本说明书中给出的计 算方法是较为简单的一种，也可参考相应论文中较为严谨的计算公式。

6. ORAC 测试的样品既可为脂溶性，也可为水溶性。脂溶性样品处理更为复杂，因此更推荐采用亲水溶剂制备样品。