ELISA检测方法原理、操作步骤及常见问题

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的实验技术。由于其高灵敏度和具体性，ELISA已成为检测抗体、激素、蛋白质和病原体的方法。

一、ELISA检测原理

基本原理

方法类型

• 直接ELISA：使用直接标记有酶的抗体对抗原进行检测。
• 间接ELISA：使用两种抗体，第一抗体特异地识别抗原，第二抗体识别第一抗体并标记有酶。
• 夹心ELISA：利用两种抗体夹住抗原，其中一种固定，另一种标记有酶。
• 竞争ELISA：抗原和标记有酶的抗原竞争同一抗体的结合位。

二、实验前的准备

实验材料

• 抗体：选择高特异性和亲和力的抗体。
• 酶标记底物：常用的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），底物选择应与酶相匹配。
• 洗涤液：通常使用含有Tween-20的PBS缓冲液以减少非特异性结合。
• 阻断液：用于阻断微孔板中未被抗体或抗原占据的位点，防止非特异性吸附。

设备与环境

• 酶标仪：用于读取酶反应产生的光信号。
• 实验室环境：需要保持清洁，温度和湿度控制适中以保证实验的准确性和重复性。

三、操作步骤详解

1. 样品准备

• 处理：取所需样品体积，如有必要，进行适当稀释以符合测试范围。

• 存储：将样品分装在避光小管中，存放于-20°C以下以避免降解。避免反复冻融，建议分装成单次使用量。

2. 加样与孵育

• 加样：在微孔板中加入50 µL样品到每个测试孔中。使用多通道移液器可以提高效率和准确性。

• 孵育：将孔板覆盖，放置在37°C孵育器中孵育1小时，或根据抗体配套文件推荐的时间进行孵育。

3. 洗涤

• 洗涤次数：用自动洗板机或手动洗板，每次加入300 µL洗涤缓冲液，静置几秒后弃液，重复此过程至少3次。

• 洗涤技巧：确保每次洗涤液充分覆盖孔底，避免泡沫产生，因泡沫可能导致孔间污染。

4. 酶标底物加入和信号发展

• 底物加入：向每个孔中加入100 µL酶底物（如TMB），在避光条件下室温孵育15-30分钟。

• 终止反应：加入50 µL的终止液（如2N硫酸），反应立即停止，并将颜色由蓝变黄。

5. 读取结果

• 使用酶标仪：在450 nm波长下读取吸光度值。如果可能，读取650 nm作为参考波长，以校正板材不均或泡沫的影响。

四、注意事项与经验分享

常见问题及对策

• 孔板交叉污染：使用新的吸头和适当的技术，如慢速释放液体到孔壁，避免液体直接冲击到孔底。

• 底物不稳定：底物开封后应避光保存，并在推荐的有效期内使用，过期底物可能导致信号弱或背景高。

经验技巧

• 提高灵敏度：优化底物的孵育时间，观察颜色变化，避免过度孵育导致信号饱和。

• 减少非特异性背景：增加阻断步骤的时间或使用高效的阻断剂，如脱脂牛奶粉或BSA，以填补未被抗体或抗原占据的微孔板表面。