双缩脲法蛋白质含量测定试剂盒说明书

分光光度法 50T/48S

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定，确保蛋白浓度在 1～10mg/ml 范围内。

测定意义：

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理：

强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为 1~10mg 蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

组成：

标准品：液体 1ml×1 瓶，5 mg/ml，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取：

1.        液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2.        组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3.        细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定步骤：

1.     分光光度计预热 30 min，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。

2.     空白管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 蒸馏水，1000μl 试剂一，混匀后室温静置 15 min，于 540nm 比色，记为 A 空白管。

3.     标准管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 标准液，1000μl 试剂一，混匀后室温静置 15 min，于 540 nm 比色，记为 A 标准管。

4.     测定管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 待测液，1000μl 试剂一，混匀后室温静置 15 min，于 540nm 比色，记为 A 测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

样品中蛋白质浓度计算公式

C 待测（mg/mL）= C 标准管×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

=5×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

注意事项：

1.  样品蛋白浓度须在 1~10mg/ml 范围内，低于 1mg/ml 不能用此法，高于 10mg/ml 须做相应稀释。因此测定前用 1~2 个样做预实验，确保蛋白浓度在 1~10mg/ml 范围内。

2.  待测样品蛋白提取可用生理盐水、双蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。该法受硫酸铵、Tris 缓冲液干扰，提取液中应不含这些物质；否则改用BCA 蛋白质含量测定试剂盒。