DNA测序的建库流程

什么是文库制备？在待测片段两端连接特定接头从而使其符合测序平台要求的过程。Illumina 芯片Flowcell(流动池)是有着8个lane(泳道)的玻璃板，每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一致的寡核苷酸(oligos，P7和P5接头)，一个lane包含两列，每一列有60个tile（每条lane有120个格子），每个tile有很多个凹坑，会种下不同的cluster（蔟），每个tile在一次循环中会拍照4次(每种碱基一次)，一次反应cycle在每条lane拍120张照片。Illumina 文库：基于TA连接P5/P7：和芯片上的oligos（P5‘/P7’）可以互补，目的是让文库接到芯片上。Index：标签，也叫Barcode，因为一个lane可以同时测多个样品，给每个样本带个帽子，测序后可以区分谁是谁的。接头连接：利用TA克隆在DNA片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列。DNA建库流程：DNA片段化、接头连接、连接产物纯化、PCR扩增、扩增产物纯化、文库长度分选片段化由于目前市场中NGS测序仪的测序长度通常在 150-550bp 之间，因此需要使用机械打断或酶切打断的方法将大片段基因组DNA片段化为小片段的DNA。片段化酶是随机内切酶，不受特定酶切位点的限制，随机切割对应模板DNA，片段化的产物属于粘性末端，后续需要进行末端修复。酶切形成两条单链末端时，产生末端的核苷酸顺序不是平齐的，称为粘性末端；产生核苷酸顺序平齐的末端，则称为平末端。