摘要】  目的 建立用反相液相色谱法同时测定脉络宁注射液中6种酚酸含量的方法。方法 采用Kromasil-C18柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：327 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。结果 新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸的线性范围分别为0.010 90～0.544 8 μg（r＝0.999 9）、0.024 06～1.203 2 μg（r＝1）、0.011 06～0.552 8 μg（r＝1）、0.015 94～0.796 8 μg（r＝1）、0.009 104～0.455 2 μg（r＝1）、0.010 37～0.518 4 μg（r＝1）,回收率分别为101.06%、100.22%、101.54%、99.42%、100.21%、101.65%。结论 本法灵敏简便,准确可靠,可作为脉络宁注射液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸含量同时测定的方法

【关键词】  脉络宁注射液；新绿原酸；绿原酸；隐绿原酸；咖啡酸；3,5-二咖啡酰奎宁酸；3,4-二咖啡酰奎宁酸；反相液相色谱法

Determination of Six Phendic Acids in Mailuoning Injection by RP-HPLC 

　　ZHANG Hui, LI Xiang, ZHOU Hong-yan, et al

　　1.Nanjing University of TCM, Nanjing 210046, China；2.Technology Center of Jinling Pharmaceutical Company, Nanjing 210009, China

    Abstract：Objective To establish a method for determination the contents of six phendic acids in Mailuoning injection by HPLC at same time. Methods Separation was performed on a Kromasil-C18 （4.6 mm×250 mm, 5 μm） column with phase consisting of 0.1% phosphoric acid-water and Acetonitrile with gradient elute at the flow rate of 1 mL/min. The UV detection wavelength was set at 327 nm and the column temperature was set at 25 ℃. The sample size was 20 μL. Results The standard cures of neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, caffeic acid, 3,5-Dicaffeoylquinic acid, 3,4- Dicaffeoylquinic acid were linear within the contentration range of 0.010 90～0.544 8 μg （r＝0.999 9）, 0.024 06～1.203 2 μg （r＝1）, 0.011 06～0.552 8 μg （r＝1）, 0.015 94～0.796 8 μg （r＝1）, 0.009 104～0.455 2 μg （r＝1）, 0.010 37～0.518 4 μg （r＝1） respectively. And the recovery rates of them were 101.06%, 100.22%, 101.54%, 99.42%, 100.21%, 101.65% respectively. Conclusion The method appeared to be simple, reliable, accurate and can be used to determine the contents of six phendic acids in Mailuoning injection.

    Key words：Mailuoning injection；neochlorogenic acid；chlorogenic acid；cryptochlorogenic acid；caffeic acid；3,5-Dicaffeoylquinic acid；3,4- Dicaffeoylquinic acid；RP-HPLC
 
    脉络宁注射液主要由玄参、金银花、牛膝、石斛组成,具有清热养阴、活血化瘀的功效,用于治疗血栓闭塞性脉管炎、静脉血栓、动脉硬化性闭塞症、脑血栓及后遗症等。方中主药金银花中含有大量的有机酚酸类,包括绿原酸、咖啡酸、棕榈酸、绿原酸异构体、异绿原酸、阿魏酰奎尼酸类等[1]。有研究表明,金银花中抑菌、抗病毒的主要有效成分为有机酚酸类化合物,而且金银花及其有机酸类具有明确的抑制血小板聚集的作用[2]。脉络宁注射液中含有金银花中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸。关于其中绿原酸的含量测定文献有所报道[3]。本试验以6种酚酸为指标,采用液相色谱法同时测定,为该制剂的质量控制提供了快速、准确的测定方法。

　　1  仪器与试药

    Waters 2690液相色谱系统；Waters 996型二极管阵列紫外检测器；M32色谱工作站；Sartorius BP211D电子天平。新绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸（均购于成都曼思特生物科技有限公司,纯度＞98%）,绿原酸（中国药品生物制品检定所,批号110753-200413）、咖啡酸（中国药品生物制品检定所,批号110885-200102）；脉络宁注射液（金陵药业股份有限公司）。乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

    色谱柱：Kromasil-C18柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；保护柱：Phenomenex-C18柱（4.6 mm×12.5 mm,5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,按表1进行梯度洗脱。检测波长：327 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。表1  梯度洗脱表（略）

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液 

　　精密称取干燥至恒重的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸对照品适量,加50%甲醇溶解,制成含新绿原酸6 μg/mL、绿原酸5 μg/mL、隐绿原酸6 μg/mL、咖啡酸3 μg/mL、3,5-二咖啡酰奎宁酸2 μg/mL、3,4-二咖啡酰奎宁酸3 μg/mL的混合对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液 

　　精密吸取脉络宁注射液1 mL,置100 mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜（0.45 μm）滤过,得供试品溶液。

　　2.3  系统适用性试验
   
　　6种酚酸的理论板数不低于3 000。各成分拖尾因子均在0.95～1.05之间,分离度均大于1.5。取混合对照品溶液,按上述色谱条件重复进样5次,新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为0.106%、0.203%、0.094%、0.104%、0.668%、0.154%。结果表明,本试验系统具有良好系统适用性。

　　2.4  线性关系考察

    分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸适量,分别置于25 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成0.272 4 mg/mL的新绿原酸溶液、0.601 6 mg/mL的绿原酸溶液、0.276 4 mg/mL的隐绿原酸溶液、0.398 4 mg/mL的咖啡酸溶液、0.227 6 mg/mL的3,5-二咖啡酰奎宁酸溶液、0.259 2 mg/mL的3,4-二咖啡酰奎宁酸溶液,备用。
    精密吸取上述对照品溶液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL分别置于50 mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,配成不同浓度的混合对照品溶液,分别进样20 μL,记录峰面积。以峰面积积分值的平均值对进样质量（μg）进行线性回归（见表2）。6种酚酸在各自设计的范围内线性关系良好（见表2）。表2  混合对照品线性回归表（略）
 
　　2.5  精密度试验

    按“2.2.2”项下方法制备同一批样品溶液,共5份,分别按上述色谱条件进行分析。测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为0.635%、0.477%、0.063%、0.686%、0.961%、0.956%。

　　2.6  稳定性试验

    取同一份供试品溶液,分别在0、1、2、3、4、6、12 h进样测定,测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为0.488%、0.165%、0.510%、0.334%、0.709%、0.264%,结果表明,供试品溶液在12 h内含量稳定。

　　2.7  专属性考察

    按处方比例及工艺,制备不含金银花的阴性样品,按“2.2.2”项下方法处理,测定,结果处方中其他药材不干扰测定。色谱图见图1。

　　2.8  加样回收率试验
   
　　精密吸取0.5 mL已知含量的样品,精密加入272.4 μg/mL新绿原酸、284.8 μg/mL绿原酸、276.4 μg/mL隐绿原酸、199.2 μg/mL咖啡酸、113.8 μg/mL 3,5-二咖啡酰奎宁酸、129.6 μg/mL 3,4-二咖啡酰奎宁酸各1.0 mL,置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,重复制备6份。按照上述色谱条件进样20 μL分析,计算含量,得到6种酚酸的平均加样回收率及其RSD（见表3）。表3  加样回收率试验结果（略）

　　2.9  样品测定
   
　　分别取3个不同批号的脉络宁注射液按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,以外标法计算,测定结果见表4。表4  不同批号脉络宁注射液6种成分含量测定结果（略）

　　3  讨论
   
　　本试验6种酚酸中绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸为同分异构体,3,4-二咖啡酰奎宁酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸也是同分异构体,色谱行为非常相似。本试验曾考察了甲醇-水-甲酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-乙酸流动相系统,其中乙腈-水-磷酸系统较为理想。通过调节色谱条件能够同时分离脉络宁注射液中所含的6种有机酚酸,均能达到基线分离。

    这6种酚酸成分zui大吸收波长为（326±2）nm,参照《中华人民共和国药典》（一部）金银花中绿原酸的含量测定方法,我们仍采用327 nm作为检测波长。

    脉络宁注射液中这6种酚酸均来源于金银花,其药理作用与脉络宁注射液一致,测定这6种酚酸的含量对脉络宁注射液整体质量控制及药代动力学研究具有实际意义。

【参考文献】
  　[1] Abraham SK, Sarma L, Kesavan PC. Protective effects of chlorogenic acid, curcuim in and a α-carotene against γ-radiation induced in vico chromosomal damaged[J]. Mutation Research,1993, 303：109－112.

　　[2] 樊宏伟,肖大伟,余 黎.金银花及其有机酸类化合物的体外抗血小板聚集作用[J].中国医院药学杂志,2006,26（2）：145.

　　[3] 李文莉,汪文涛,曹湘萍.液相色谱法测定脉络宁注射液中绿原酸的含量[J].中国药学杂志,2003,38（3）：210.