ELISPOT 实验原理

来源：北京平利洋医疗设备有限公司 2024年09月11日 08:40

酶联免疫斑点技术 (Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT) 是细胞免疫学研究中的检测方法之一，广泛应用于测定分泌特异性抗体或细胞因子的单个细胞对特异性抗原免疫应答能力的细胞免疫学技术。

由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等具有更高的灵敏性。ELISPOT 技术可精确测量分泌细胞的比例，达到 1/1000000 细胞的灵敏度，比传统方法高2个数量级。与基于流式细胞术的细胞内染色法 (Intracellular Cytokine Staining, ICS) 相比较，ELISPOT 技术不仅可在分泌细胞周围持续捕获细胞因子。同时，在检测细胞因子的分泌时，不需要添加分泌抑制剂处理细胞。

ELISPOT 实验原理

免疫细胞在刺激物存在的条件下被激活，其分泌的细胞因子/免疫球蛋白被 ELISPOT 板底 PVDF 膜上 (预包板) 的特异性单抗捕获，去除细胞后，被捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合，其后二者再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，加入底物显色后，PVDF 膜上有反应作用的细胞会留下直径大小不等的染色斑点，通过酶联免疫斑点分析仪 (ELISPOT Reader) 对斑点进行自动计数和分析 (图1)。

基于荧光检测 ELISPOT 的方法 (FluoroSpot)：同样采用夹心法原理，96孔板的 PVDF 膜上同时包被多种不同因子的捕获抗体，细胞经过刺激培养后，分泌的细胞因子被板底的捕获抗体所捕获，再同时加入两个检测抗体，其中一种检测抗体带上 Tag 标签，另一种检测抗体带 Biotin 标签，最后加入 anti-tag 和 Streptavidin 标记的荧光素进行标记。仪器中含有滤光片，可以精确的检测到目标荧光，而遮蔽掉其它颜色荧光，并且保证荧光之间可以互不干扰。生成荧光斑点通过 FluoroSpot 读板仪进行斑点计数和数据分析。

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酶联免疫斑点技术 (Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT) 集高灵敏度、高通量、单细胞水平、多重功能性检测等优点于一身，被广泛应用于疫苗免疫原性的效价评估、细胞治疗的效价评估、基因治疗的毒性评估、传染性疾病/自身免疫性疾病的诊断和疗效评估以及肿瘤治疗的疗效评估、移植免疫排斥的研究以及基础免疫学等的研究中。

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