假阳性？条带不对？菌液PCR问题一网打尽

1.平板长菌，但挑的单克隆菌落摇不起来？

产生原因及解决办法：

（1）挑取的单克隆为杂菌，呈假阳性。出现这种情况的原因包括：①配制平板过程中，加入抗生素时温度过高致使抗生素灭活；②配制平板过程中，抗生素浓度过低；③平板培养时间太长导致抗生素失效。

（2）液体培养基的抗生素使用错误。

（3）液体培养基抗生素浓度过高，导致大肠杆菌生长缓慢。

（4）菌液保存太久，导致菌的活力过低。办法：重新划线涂板，挑取单克隆。

（5）自己制备的感受态细胞受到杂菌污染。

（6）噬菌体污染。现象描述：菌液清亮或浑浊后变为清亮，底部有沉淀。办法：甲醛熏蒸超净台，对整个实验环境进行消毒；重新提质粒，重新转化。

2. 平板长菌，挑的单克隆菌落能摇起来，但菌液PCR没有条带？

产生原因及解决办法：

（1）重组或连接失败。出现这种情况的原因包括：①质粒没有切开；②质粒切开后自连。

（2）摇菌时间过长，菌液浓度过大。办法：摇菌不超过6小时，4-5小时即可。

（3）PCR反应体的原因。出现这种情况的原因包括：①酶；②引物。办法: 换酶，使用热启动酶；使用载体通用引物。

3. 平板长菌，挑的单克隆菌落能摇起来，但菌液PCR与阳性对照的大小不对？

产生原因及解决办法：

（1）引物特异性差，导致扩增到大肠杆菌的基因。办法：使用载体的通用引物。

（2）目的基因存在所用酶的酶切位点，酶切位点切错，仅部分连接，导致片段变小。

（3）小片段核酸污染。这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后扩增出条带。

（4）琼脂糖凝胶电泳会产生偏差，相差一点极有可能是目的条带。办法：送测序进行验证。

4. 平板长菌，挑的单克隆菌落能摇起来，但菌液PCR出现多条条带？

产生原因及解决办法：

（1）引物特异性差，导致扩增到大肠杆菌的基因。办法：使用载体的通用引物。

（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，PCR循环次数过多。

（3）酶量过多或酶的质量差。

（4）菌落污染。

5. 平板长菌，挑的单克隆菌落能摇起来，菌液PCR也有目的条带，但测序无信号？

产生原因及解决办法：

（1）未连接到载体的目的片段仍存在在菌液里，单克隆的菌落为原始质粒，菌液PCR有条带。

（2）污染。出现这种情况的原因包括：①菌液污染。②酶，引物，Buffer等污染。③气溶胶污染。

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