乳酸含量（LA）检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1259

产品规格：100管/48样

产品简介：

乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD⁺还原生成NADH和H⁺，H⁺传递给PMS生成的PMSH₂还原MTT生成紫色物质，在570nm处有特征吸收峰。

技术指标：

检出限：0.0771μmol/mL

线性范围：0.078-5μmol/mL

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL的比例配制试剂二溶液，现用现配；

2. 试剂三：临用前加入4mL蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周；

3. 试剂四：临用前加4mL蒸馏水充分溶解，4℃保存一周；

4. 试剂五：临用前每瓶加入3mL蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周；

5. 标准品：临用前加入1.04mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液；

6. 显色液的配制：临用前根据用量按照试剂三（V）：试剂四（V）=1：1的比例充分混匀，现配现用。

需自备的仪器和用品： 

天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、乙醇和蒸馏 水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

3. 血清（浆）：取100μL血清（浆）加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g离心10min后取上清待测。

二、测定步骤 

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至570nm，分光光度计用乙醇调零。

2. 标准液的稀释：将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL的标准溶液待测。

3. 加样表：

三、乳酸含量的计算

标准曲线的绘制

1. 以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（ΔA标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入公式中得到x（μmol/mL）。

2. 乳酸含量计算

（1）按照样本蛋白浓度计算

LA含量（μmol/mg prot）=x×V样本÷（V样本×Cpr）=x÷Cpr

（2）按照样本质量计算

LA含量（μmol/g质量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照细胞数量计算

LA含量（μmol/10⁶ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（5×V上清÷V提取液一）=0.2375×x

（4）按照液体体积计算

LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]=13.0625×x

V样本：加入的样本体积，0.01mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：加入的提

取液一体积，1mL；5：细胞数量，5×10⁶个；V液体：液体样本体积，0.1mL。

注意事项:

如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

实验实例： 

1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后稀释5倍，之后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.591-0.069=0.522，根据标准曲线 y=0.412x-0.0214，x=1.319，按样本质量计算含量得：

LA含量（μmol/g质量）=1.1875×x÷W×稀释倍数=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32μmol/g质量。

2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.572-0.211=0.361，根据标准曲线y=0.412x-0.0214，x=0.928，按照液体体积计算含量得：

LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122μmol/mL。

相关发表文献：

[1]  Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

[2] Xiaojin Luo,Weihua Shi，Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)

[3] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

参考文献：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.