脾脏处理

1.将两个已解剖分离的脾脏，置于一个15 mL离心管顶部配备的70 μm细胞筛网上。使用无菌注射器的柱塞，以温和力度将脾组织压碎以通过细胞筛网进行匀浆处理，确保不破坏细胞结构。在整个过程中，分次使用总计6 -10mL的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，逐步冲洗筛网以收集细胞。2.将收集到的细胞悬液以500 × g离心5分钟，随后，小心地去除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL的红细胞裂解缓冲液中，在室温下静置孵育5分钟。孵育结束后，迅速加入10 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）以终止红裂过程，再次以500 × g离心5分钟。若沉淀中仍有残留红细胞，需重复上述裂解和洗涤步骤，直至肉眼所见无红色。3.细胞计数与活力检测：完成裂解后，以500 × g离心5分钟，丢弃上清液，然后将细胞沉淀用1 mL PBS重新悬浮。接下来，采用台盼蓝排除法鉴别活细胞，在血细胞计数板上进行精确的细胞计数，以确定活细胞的数量。这种方法基于台盼蓝无法穿透活细胞膜而能够染色死细胞的原理，从而区分出活细胞和死细胞的比例及总数。4. 通过流式检测抗体标记的脾脏细胞。尤其需要注意一点，对于脾脏巨噬细胞的流式检测，在抗体标记前，需要Fc受体的封闭，避免非特异染色。5. 大家拿到自己的流式结果后，如果实验结果不符合自己的预期。这时最需要做的就是质控自己的流式数据，比如细胞的分群，大概比例，细胞的死活，细胞的数量，分群是不是集中，一定要找文献，无论如何，对照组的正常小鼠，这个数据是可以参考的。如果自己的流式数据对着文献都不太符合常规，就不要给给实验下结论。这时，基础的实验体系就有问题。

6. 对于巨噬细胞，CD11b和F4/80双标，肝脏和脾脏，还有腹腔，肯定会有三群（根据这两个maker的表达高低）。对于很多用荷兰liposoma品牌的巨噬细胞清除剂clodronateliposomes氯膦酸二钠脂质体的客户来说，清除组和对照组，也可以参考这个图。