qPCR实验中，引物设计也是非常重要的一个环节，引物的合适与否与扩增效率是否达标、扩增产物是否特异、实验结果是否可用等息息相关。

设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：引物尽量要跨内含子设计、产物长度100~300 bp、Tm值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C等等。

1. 引物跨内含子设计

在设计qPCR引物时，选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增，产物均来源于cDNA的扩增，这样也就去除了gDNA污染造成的影响。

2. 引物长度

引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物长度尽量控制在 100~300 bp之间。

引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应，会影响到PCR扩增效率。

3. GC含量和Tm值

引物GC含量控制在40%~60%之间，过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同，以便获得相同的 Tm值和退火温度。

Tm值应尽量在55~65℃之间，一般为60℃左右，上下游的Tm值应尽量姐接近，最好不超过4℃。

4. 引物3′端末端避免选择A

引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大的差异，当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成，而当末位为T时，错配引发效率大大降低。因此引物3’端尽量避免选择A，最好选择T。

若为探针引物，则探针5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

5. 碱基分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，3′端避免超过3个连续的G或C，3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区产生配对。

6. 引物设计区域应避开复杂二级结构。

扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行，可通过提前预测靶序列是否存在二级结构，尽量避开该区域设计引物。

7. 引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补。

引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠形成发夹结构，而影响引物与模板的复性结合。

上下游引物之间也不能存在互补序列，引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性。如果引物二聚体及发夹结构不可避免，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。

8. 引物扩增的是目标特异产物。

qPCR检测最终目的是了解目的基因的丰度，如果出现非特异扩增，定量会不准确。所以设计好引物后，需要对其进行BLAST检测，在序列数据库中比对产物的特异性。