缺血性脑卒中是全球主要死亡原因之一，主要的临床治疗方法包括药物溶栓和血栓切除术。然而，这些手术后的快速再灌注可能会损害脑功能并恶化卒中的预后，从而导致脑缺血再灌注损伤（IRI）。缺血性卒中导致脑血流量减少，使内皮细胞暴露于相对较低的剪切应力（LSS）中。有趣的是，再灌注治疗可恢复生理流体剪切应力（PFSS），但也增加了更严重的再灌注损伤的风险。然而，FSS 在再灌注损伤和修复中调节内皮功能的机制仍然难以捉摸。

许多外部生化和生物物理刺激，包括转化生长因子-β （TGF-β） 和机械应力，都可以刺激血管内皮细胞中内皮-间充质转化（EndMT）的发生。与 EndMT 相反，间充质-内皮转化（MEndT）通过上调内皮相关标志物来恢复内皮细胞的特性和功能。尽管先前的研究已经证明了 EndMT 对动脉粥样硬化病变和斑块不稳定的贡献，FSS 诱导的 EndMT 对脑 IRI 的影响尚未阐明。内皮炎症与 EndMT 的发生发展密切相关。研究表明，炎症是再灌注损伤的普遍病理特征，在继发性脑损伤中起重要作用。然而，在再灌注治疗后，由于局部生理血流的恢复，缺血性脑组织发生了更严重的炎症损伤反应，这种炎症性损伤的加重与内皮细胞功能障碍密切相关。因此，需要进一步探索脑缺血-再灌注损伤和修复过程中内皮炎症与 EndMT 之间的关系。

作为广为人知的机械传感器，Yes相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）对机械刺激做出反应并易位到细胞核中以启动基因转录。研究表明，FSS 诱导 YAP 从细胞膜到细胞核的易位，促进上皮-间充质转化（EMT），并增强肝细胞癌的转移。也有研究表明，血流依赖性 YAP/TAZ 活性调节动脉粥样硬化的内皮表型，且 YAP 作为机械反应分子调节内皮炎症。然而，在脑缺血再灌注损伤和修复期间尚不清楚 YAP 是否在调节 EndMT 和内皮炎症反应中发挥转录作用。

最近，在四川大学华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室课题人员的一项工作中，构建了大脑中动脉栓塞体内模型（MCAO）和体外平行平板流室模型，以探讨 FSS 对 IRI 过程中内皮表型转化和炎症的影响，同时，利用 mRNA 测序技术检测了触发 YAP 激活的细胞骨架相关信号通路。研究结果为 IRI 的治疗提供了新的视角。研究成果发表在 APL Bioengineering 期刊题为“Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair”。

首先，将大鼠随机分为4组，包括 Sham（假手术组）、IS（缺血2h）、IS/RE（缺血2h + 再灌注1d）和 IS/RL（缺血2h + 再灌注30d），检测了早期和晚期再灌注期间的内皮炎症，发现早期再灌注时的炎症明显加重，但随着再灌注时间的延长而缓解。通过观察再灌注各阶段中 EB 荧光强度，发现在再灌注早期，炎症的加重使血脑屏障（BBB）通透性增加。并进一步观察到 BBB 的紧密连接，且随着再灌注时间的延长，BBB 的功能逐渐恢复。

为了在体外研究 FSS 与 IRI 的关系，将大鼠脑微血管内皮细胞（rBMECs）暴露于 0.5 dyn/cm2 LSS 6h（LSS 组），然后将 FSS 增加到生理水平 2 dyn/cm2 分别持续 2h（LSS/EP 组）和 12h（LSS/LP 组）。结果发现，NF-ĸB P65 在早期缺血再灌注阶段（LSS/EP组）从细胞质进入细胞核，这意味着内皮炎症明显加重（图1 a）。值得注意的是，在 LSS 和 LSS/LP 组中，NF-ĸB P65 的定位于细胞质。此外，LSS/EP 组 TLR4、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNF-α 和NF-ĸB 等炎症相关因子的 mRNA 表达均高于 LSS 组和 LSS/LP 组（图1 b、c）。与 LSS/EP 组相比，这些因子在 LSS/LP 组表达降低，提示内皮炎症随着再灌注时间的延长而减轻（图1 b、c）。上述结果表明，缺血再灌注的早期阶段（暴露于FSS，0.5-2 dyn/cm2）诱导炎症反应加重，随着再灌注时间的延长，rBMECs 缓解了炎症反应。

为了进一步验证内皮炎症诱导的 BBB 功能障碍，通过 TEM 检查了紧密连接（TJs）的形态，发现 LSS 组加载 6h 的条件下，在相邻的 rBMECs 中找到分离的TJs结构。特别是，当 rBMECs 暴露于2 dyn/cm2 FSS 2h 时，LSS/EP 组中 TJs 的结构在某些区域变得不规则、分离甚至丢失。此外，还检测了每组 rBMECs 中 TJs 相关蛋白 Claudin 5、Occludin 和 ZO-1 的表达，发现与 LSS 组相比，LSS/EP 组的表达水平显著降低，表明炎症加重诱导了 TJs 丢失，但在 LSS/LP 组中上调，表明在 12h 生理 FSS 条件下炎症缓解，内皮屏障恢复。

这些发现表明，在再灌注的早期阶段，通过下调 TJ 相关蛋白，增强的炎症反应导致血脑屏障和内皮功能障碍。细胞逐渐适应连续的生理 FSS，并恢复内皮表型和功能。

图1    FSS诱导的内皮炎症和血脑屏障功能障碍。

接下来，为了探究 FSS 调控 IRI 炎症的分子机制，对暴露于 FSS 的 rBMECs 进行了第二代 mRNA 测序。结果显示，与 LSS 组相比，LSS/EP 组的内皮标志基因表达显著下调，而间充质标志基因和炎症相关基因的表达显著上调。然而，与 LSS/EP 组相比，LSS/LP 组间充质标志基因和炎症相关基因显著下调，而内皮标志基因显著上调。

KEGG分析表明，显著表达的差异基因涉及的主要信号通路为肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑、紧密连接、PI3K-Akt 信号通路等，特别是肌动蛋白细胞骨架通路对 IRI 的贡献。

根据 mRNA 测序结果，进一步探讨了 IRI 和修复的机制。研究人员假设内皮细胞的内皮和间充质表型之间的转化导致了再灌注过程中的炎症。一方面，与体内 IS 组相比，IS/RE 组间充质标志物明显上调，表明 EndMT 发生在脑微血管内皮细胞中。然而，这些间充质标志物在 IS/RL 组中显著降低，表明脑微血管内皮细胞中发生了逆转的 MEndT 事件（图2 a）。另一方面，LSS/EP 组的 VE-钙粘蛋白（内皮标志物）从细胞膜易位到细胞质（图2 d），其表达水平也显著下调（图2 e），而间充质标志物水平显著升高（图2 b、c）。这些结果提供了强有力的证据，表明在暴露于 0.5-2 dyn/cm2 FSS 的 rBMECs 中触发了 EndMT 过程。有趣的是，随着 2 dyn/cm2 的 FSS 从 2h 增加到 12h，LSS/LP 组 VE-钙粘蛋白的表达显著上调（图2 e），而间充质标志物水平显著下降（图2 b、c）。

这些结果表明，FSS 水平的降低触发了 rBMECs 的 EndMT 过程，而恢复的 FSS 则以时间依赖性的方式导致了逆转的 MEndT 事件。

图2     连续改变FSS诱导rBMEC 表型转化。

最后，实验讨论了 FSS 诱导的内皮细胞经历 EndMT 和炎症的潜在生物力学机制。在大鼠 MCAO 模型中发现 YAP 在 IS/RE 组中高表达并易位到细胞核。然后，通过敲低 YAP 检测 EndMT 标志物的表达来验证 YAP 在脑 IRI 期间 EndMT 和炎症中的作用。与图2的结果相反，FSS-shYAP 消除了由 VE-钙粘蛋白上调和 N-钙粘蛋白下调所指示的这些间充质转化，表明 FSS-shYAP rBMECs 维持了内皮表型（图3 a-c）。据报道，MMP-2 表达的增加通常与 EMT 的诱导有关。实验发现，YAP敲低后，所有组的 MMP2 表达没有变化。此外，与 LSS 相比，暴露于 PFSS 的 sh-rBMECs 中间充质标志物 α-SMA 的表达上调，但 PFSS/EP 组与 PFSS/LP 组间无显著差异。同时，炎症因子 TNF-α 的表达在 LSS、LSS/EP 和 LSS/LP 组均无显著变化（图3 d-f）。这些结果证实了 YAP 参与调节 EndMT，与脑缺血灌注损伤和修复过程密切相关。

已知肌动蛋白细胞骨架通路对 IRI 的贡献最为显著。机械线索调节 Rho GTPases 的活性，进而导致肌动蛋白细胞骨架重塑。与静态对照组相比，LSS 组的 RhoA、Cdc42 和 Rac1 表达显著上调，在 LSS/EP 阶段显著下调，表明 Rho GTPases 响应 FSS 并可能调节细胞骨架重塑。

此外，还探讨了肌动蛋白在 YAP 激活中的作用。发现 FSS 诱导F-肌动蛋白纤维的重塑和重排，但可以被细胞骨架抑制剂 Lat B 显著抑制。Lat B 处理后，LSS/EP 期内皮标志物表达显著上调，间充质标志物表达显著下调。所有组中炎症因子 TNF-α 的表达均无显著差异。这表明细胞骨架的抑制导致 rBMECs 恢复内皮表型并减轻炎症。

这些发现表明，YAP 通过 Rho GTPases-F-actin 信号通路介导脑 IRI 中的 EndMT。

图3    YAP 介导的 FSS 调节脑 IRI 中的 EndMT。

图4   FSS 诱导的内皮表型转化导致内皮炎症促进缺血再灌注损伤和修复的示意图。

（a）在早期再灌注时，恢复的血流供应（剪切应力强度增加）在 ECs 中诱导 EndMT，导致炎症和血管损伤加重。在晚期再灌注时，ECs逐渐适应生理剪切水平（剪切应力持续时间增加），恢复内皮表型（MEndT），并减轻内皮炎症。（b）FSS 的暴露强度和持续时间不断变化，ECs 经历了内皮间充质表型（从 EndMT 到 MEndT），该表型依赖于 Rho GTPases——F-actin 来调节 YAP 的激活。

综上所述，该研究证明了 FSS 在早期再灌注时从 LSS 转变为 PFSS，通过调节 rBMECs 中的 EndMT 转化诱导炎症损伤和脑损伤。然而，随着再灌注时间的增加，内皮细胞逐渐适应PFSS并经历逆转的 MEndT，从而恢复其内皮表型，并缓解晚期再灌注期间的内皮炎症和脑损伤。这项研究为针对IRI的治疗策略提供了宝贵的见解。

参考文献：Sun D, Ma J, Du L, Liu Q, Yue H, Peng C, Chen H, Wang G, Liu X, Shen Y. Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair. APL Bioeng. 2024 Feb 26;8(1):016110. doi: 10.1063/5.0174825. PMID: 38414635; PMCID: PMC10898918.

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