一， 酶功能及适用范围介绍

细胞作为生物的基本结构单元（病毒除外），在生命活动过程中扮演着重要角色，在生物医药领域经常被用于基因和药物研究的工具。实验使用到的细胞主要是细胞系（Cell line）和原代细胞（Primary cells），这两种细胞各有优缺点，例如原代细胞能够很好地模拟生物体内的环境但是重复性差；细胞系虽然重复性好，但是不能很好地模拟生物体内的环境。因此，很多时候在实验会需要进行原代细胞的分离，对于原代细胞的分离主要是酶消化法，参与消化的酶因组织差异而存在不同，下边就介绍一下实验室常用的用于分离原代细胞的酶。

（图1 原代细胞与细胞系的比较）

胰蛋白酶（Tyrisin）是目前各细胞实验使用广泛的细胞/组织消化试剂，工作浓度在0.25%胰酶（外加0.02%EDTA（0.53mM）），它适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织原代细胞的分离以及实验室的细胞传代。它的作用机制是作用于精氨酸或赖氨酸相连接的肽腱，消除细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使组织分散成单个细胞而分离获得原代细胞（Primary cells）。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA）是，一种金属螯合剂，用于螯合培养基或平衡液中的二价离子，有助于增强胰蛋白酶的水解功能；此外血清能够降低胰酶活性，因此在终止消化的时候可以添加至少5%的血清去终止胰酶的消化。

二， 胰蛋白酶配制

胰蛋白酶（Tyrisin）是为一种蛋白酶，在细胞培养实验和原代细胞分离过程很常见，尤其是细胞传代或冻存消化过程最常见的酶，在此以0.25%胰酶配制举例：

（1）称取胰酶：电子天平称取0.25g胰蛋白酶（Tyrisin），然后溶于100ml 无菌PBS；（2）低温低速搅拌：在胰蛋白酶加入到PBS中后，需要低温长时间搅拌（4℃/冰浴，过夜-12-16h）；（3）调节pH:胰酶的最佳消化pH在7.4左右，因此需要调整pH；（4）过滤分装：一般使用0.22μm滤器进行过滤，这样几乎就消除了细菌，可以多过滤1-2次，尤其在大批量制备时候；（5）分装保存：根据实验室的使用情况进行分装，然后冻存在-20℃，正在使用的少量胰蛋白消化液于4℃保存即可；

（备注：低速配制，高速会导致胰蛋白酶气泡进而酶的效力大大折扣，如果要加强消化能力，可以添加终浓度为0.02% EDTA（0.53mM）主要是消除PBS中Ca2+的影响，增强酶活性。）

三，原代细胞的分离（以小鼠肾脏为例）

对于原代细胞的分离成功与否最关键因素有三：（1）全程无菌操作；（2）选择合适的酶和浓度；（3）选择合适的消化时间。现在以小鼠肾脏为例，进行原代细胞分离的剖析：

（a）准备工作

对于原代细胞分离培养通用的准备工作主要涉及培养基（普通培养基，可以适当添加细胞因子Egf和/或bFGF）、无菌操作环境（紫外灯15-30 min）、实验器材高压灭菌、实验动物。

（图2 小鼠肾脏原代细胞分离示意图）

（b）细胞分离步骤

（1）小鼠安乐/牺牲：大家要慢慢养成尊重动物福利的习惯，不然后期各方面不好说，尤其是面向世界各地研究员；

（2）暴露小鼠腹腔：使用镊子夹住小鼠（3周左右）腹部表面皮肤，在腹部中间横向开口约0.5cm，然后让皮肤直接往上扯（有点残忍，但是显著性减少细菌感染）；当然有可以把腹部皮肤逐步用镊子扯开，然后露出完整腹膜（千万别弄破）；

（3）取出肾脏器官：使用无菌剪刀将腹膜纵向剪开，然后在小鼠腰部找到肾脏组织，使用镊子将其取出；

（4）组织杀菌：将肾脏组织转移至约10mlPBS（含3x or 2x 青霉素-链霉素）中反复颠倒消毒3-5 min；

（5）组织破碎：根据组织块的大小（一般建议不超过1cm3）,转移直尖底1.5ml EP管中，加入适量消化液（总体积不超ep管2/3），然后使用眼科钳充分剪碎组织；

（6）胰酶消化：使用终浓度为1-2 mg/ml胶原酶 Ⅰ在37℃震荡水浴摇床消化20-30min，可以在消化10min、15min、20min、25min、30min取出少量消化液查看消化液中单个细胞的情况（是否存在皱缩/组织块），进而确定最佳消化时间。

（7）过滤：体细胞直径一般在10-20μm之间，但组织原代酶消化时候，不能用稍大一些的滤器，而是要大得多的滤器（能过滤掉组织就行），一般选择200-400目（数值越大，滤网直接越小）；

（8）离心收集细胞：在1000rpm左右离心5min获得的过滤细胞悬液，并使用4℃预冷的培养基/PBS洗涤细胞3-5次；

（9）细胞种植：根据细胞计算，按照不同尺寸的细胞培养皿种植细胞，一般在培养皿的80-90%融合率即可，因此此时刚分离非细胞，可能细胞的分离有利于细胞生长，但是浓度太高则会因为分离过程存在死亡细胞，会释放大量的损伤相关分子模式（DAMP）损伤正常细胞；

（10）细胞观察与换液：一般在种植24h左右换液并观察细胞，在36-48h根据细胞的密度和细胞状态两个因素，确定继续培养还是传代或者后续实验。