RNA研究的进展，离不开工具酶的发现和改造。今天，我们要向大家介绍一种在RNA研究中至关重要的工具酶——T4 RNA Ligase 1。

T4 RNA Ligase 1是一种ATP依赖性的酶，能催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸之间形成磷酸二酯键的连接反应。它对于RNA分子间的连接尤为高效，其次便是DNA与RNA之间的连接，而在连接DNA分子时效率相对较低。因此，T4 RNA Ligase 1也被称为“单链RNA连接酶”。在应用方面，T4 RNA Ligase 1广泛应用于多个分子生物学领域，包括microRNA (miRNA)检测、RNA文库构建、环状重测序（CirSeq）、向导RNA（gRNA）和环状RNA（circRNA）合成等实验中。

图1. T4 RNA Ligase 1连接类型示意图

miRNA检测在深入理解基因调控机制、发现疾病相关标志物、指导早期诊断、预后评估和制定治疗策略等方面具有关键作用。然而，由于miRNA的长度一般只有20-30 nt，与标准PCR引物长度相近，这给检测带来了一定的困难。

为了解决这个问题，科学家们巧妙地利用T4 RNA Ligase 1将miRNA首尾相连成为circRNA，并结合RT-qPCR技术，研发出了一种名为miR-ID的新型检测方法。miR-ID技术有效地解决了传统RT-qPCR方法在miRNA检测时复杂的茎环逆转录引物设计问题，同时，其滚环逆转录过程能够生成含有大量重复目标序列的cDNA，这使得miRNA和其他小RNA分子的检测变得极为灵敏。这一创新为miRNA检测提供了一种更为可靠和有效的工具，进一步推动了miRNA研究和临床应用的发展。

miR-ID包括以下步骤：

图2. T4 RNA Ligase 1应用于miR-ID流程图[1]

构建RNA测序文库是一个复杂的多步骤过程，涉及RNA的富集、片段化、逆转录成cDNA、接头连接以及PCR扩增等关键步骤。传统方法中，这流-程不仅繁琐，还要求进行三次样品纯化，增加了实验的时间和成本。此外，使用随机引物进行cDNA合成可能会引入偏差，导致反转录效率不均一，从而影响测序结果的准确性。

T4 RNA Ligase 1的引入为简化建库流程带来了突破。它允许直接在断裂的RNA分子上连接接头，绕过了随机引物的使用，从而避免了由反转录不平衡引起的扩增偏差。通过采用T4 RNA Ligase 1，测序文库构建的质量得以提升，而且纯化步骤从三步缩减至两步，显著节约了纯化试剂和时间，并减少了实验操作的复杂性与劳动成本，使得整个建库流程更为高效和经济。

图3. T4 RNA Ligase 1应用于RNA建库流程图[2]

在解读NGS数据时，如何准确区分真正的基因变异和测序错误是一个具有挑战性的问题。这些错误可能源自两个主要方面：NGS测序过程中的误差以及文库制备阶段的错误。CirSeq是一种高效且高精度的RNA病毒群体二代测序技术。它利用T4 RNA Ligase 1将病毒RNA片段环化并转化为串联重复的cDNA序列。在测序过程中，对每个读段中的冗余拷贝进行比对，从而得到与初始RNA模板一致的序列。这种方法产生的测序数据错误率远低于RNA病毒变异频率，有助于超罕见变异的检出和低频变异的准确测量。

图4. T4 RNA Ligase 1应用于CirSeq流程图[3]

CRISPR/Cas系统，一种广泛使用的基因组编辑技术，它由Cas蛋白和人工重组的gRNA组成。这种系统能够精确指导Cas蛋白对目标基因进行敲除、插入和突变修饰。目前，我们主要采用体外转录和化学合成的方法来制备gRNA。化学合成法凭借其编辑效率高、细胞毒性低以及稳定性好等优点，在实际应用中得到了广泛的认可。然而，这种方法也存在一些局限性，如合成长度的限制以及副产物难以 去除等问题。为了克服这些困难，研究者们已经尝试使用RNA连接酶将多个合成的RNA连接在一起，通过这种方式，提高gRNA的纯度、产量和完整性，从而有效提高编辑效率并减少非特异性编辑的发生。

图5. T4 RNA Ligase 1应用于gRNA合成示例

线性RNA在生物学研究和治疗中具有广泛的应用，然而其较短的半衰期限制了其在长期蛋白质翻译方面的应用。与此不同，circRNA是一种闭合环状结构的RNA，广泛存在于各种生物体中，具有更高的稳定性和非帽依赖蛋白质翻译的特点。因此，circRNA疫苗被认为是新一代RNA疫苗及药物的潜在选择，具备更简单、稳定性更好和持久性更长的优势。目前，合成circRNA的方法主要包括酶促连接合成和化学合成两种。其中，酶促连接合成通过体外转录反应实现，利用DNA模板、T7 RNA聚合酶和RNA连接酶(如T4 RNA Ligase 1)等进行。酶促连接合成能够以较低成本实现更长的circRNA合成，因此在目前被广泛应用。

图6. T4 RNA Ligase 1环化机理

T4 RNA Ligase 1作为一种多功能酶，在RNA研究中发挥着至关重要的作用，其应用不仅限于上述领域。翌圣生物专注于RNA研究领域，提供与RNA研究相关的工具酶原料，为RNA研究技术的应用和发展提供支持。

参考文献：

[1] Kumar P, Johnston B H, Kazakov S A. miR-ID: a novel, circularization-based platform for detection of microRNAs[J]. Rna, 2011, 17(2): 365-380.

[2] Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure[J]. PloS one, 2015, 10(5): e0126049.

[3] Acevedo A, Andino R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nat Protoc. 2014;9(7):1760-1769. doi:10.1038/nprot.2014.118.