中华人民共和国国家标准

GB 5009.285-2022

食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定

前言

  本标准代替GB 5413.14-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。

  本标准与GB 5413.14-2010相比，主要变化如下：

  ——增加了第一法液相色谱法；

  ——增加了第二法液相色谱-质谱法；

  ——删除了规范性引用文件；

  ——修改了原微生物法为第三法。

1范围

  本标准规定了食品中维生素B12的测定方法。

  第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素B12的测定。

  第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。

  第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。

第三法 微生物法

16 原理

  维生素B12是莱士曼氏乳酸杆菌生长所必需的营养素。在一定条件下，莱士曼氏乳酸杆菌的生长与维生素B12的含量成对应关系。根据维生素B12的含量与透光率（或吸光度值）的标准工作曲线，计算出试样中维生素B12的含量。

17试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

17.1 试剂

17.1.1氯化钠（NaCl）。

17.1.2无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）。

17.1.3无水偏重亚硫酸钠（Na2S2O3）。

17.1.4 一水合柠檬酸（C6H8O7·H2O）。

17.1.5氢氧化钠（NaOH）。

17.1.6盐酸（HCl）。

17.1.7乙醇（C2H6O）。

17.2 菌株

  莱士曼氏乳酸杆菌（ Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830或等效菌株。

17.3标准品

  维生素B12（氰钴胺素）标准品（C63H88CoN14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥99% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

17.4试剂配制

17.4.1乙醇溶液（25%）：量取250 mL乙醇，加水稀释至1 000 mL，混匀。

17.4.2氯化钠溶液（9 g/L）：称取9.0g氯化钠溶于1 000 mL水中，分装于具塞试管中，每管10 mL，121℃灭菌15 min。

17.4.3盐酸溶液（1 mol/L）：量取90 mL盐酸，加水稀释至1 000 mL，混匀。

17.4.4氢氧化钠溶液（1 mol/1）：称取40g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 000 mL，混匀。

17.4.5提取溶液：称取无水磷酸氢二钠1.3 g，无水偏重亚硫酸钠1.0g，一水合柠檬酸1.2 g，用100 mL水溶解。

17.5标准溶液配制

17.5.1维生素B12标准储备液（10μg/mL）：称取10 mg（精确至0.01 mg）维生素B12标准品于50 mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至1 000 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀。转移至棕色试剂瓶中，于-20℃下避光保存，有效期3个月。

17.5.2维生素B12 中间液（100 ng/mL）：准确吸取1.00 mL.维生素B12标准储备液，置于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期3个月。

17.5.3维生素B12标准工作液（1 ng/mL）：准确吸取1.00 mL维生素B12标准中间液，置于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。临用现配。

17.5.4维生素B12标准使用工作液：分别吸取5 mL维生素B12标准工作液置于250 mL和500 mL容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL；低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。临用现配。

17.6培养基

17.6.1乳酸杆菌琼脂培养基：配制方法见D.1。

17.6.2 乳酸杆菌肉汤培养基：配制方法见D.2。

17.6.3维生素B12测定用培养基：配制方法见D.3。

  注：商品化的合成培养基，按照说明书操作。

17.7 材料

17.7.1无菌吸管：10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器和吸头。

17.7.2瓶口分液器：0 mL~10 mL。

17.7.3锥形瓶：200 mL。

17.7.4容量瓶（A类）：100 mL、250 mL、500 mL。

17.7.5单刻度吸管（A类）：5 mL。

17.7.6漏斗：直径90 mm。

17.7.7定量滤纸：直径90 mm。

17.7.8试管：18 mm× 180 mm。

17.7.9玻璃珠：直径约5 mm。

  注：准备玻璃器具时，使用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬质玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后的玻璃器具于200℃干燥2 h。

18仪器设备

18.1 天平：感量为0.01 g、0.001 g和0.00001 g。

18.2 pH计：精度0.01。

18.3 分光光度计。

18.4 恒温培养箱：36℃±1℃。

18.5 振荡培养箱：36℃±1℃，振荡速度140 r/min~160 r/min。

18.6压力灭菌器：121℃（0.10 MPa~0.12 MPa）；125℃（0.13 MPa~0.15 MPa）。

18.7恒温仪（或水浴锅）：100℃±1℃。

18.8离心机：转速≥2 000 r/min。

18.9 冰箱：2℃~8℃。

18.10涡旋振荡器。

18.11 均质器。

19试验步骤

19.1 测试菌液的制备

19.1.1菌株复苏：将莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）的冻干菌株活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±1℃培养18h~24 h。再转种2代~3代来增强活力。置2℃~8℃冰箱保存备用。每15d转种一次，传代次数不能超过15次。

19.1.2 菌悬液制备：将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃±1℃培养18 h~24 h，以2 000 r/min离心2 min~5 min，弃去上清液，加入10 mL 9 g/L氯化钠溶液，混匀，再离心2 min~5 min，如前操作，弃去上清液，再加10 mL 9 g/L氯化钠溶液，混匀。

19.1.3测试菌液：吸适量菌悬液于10 mL g/L氯化钠溶液中，混匀制成测试菌液。用分光光度计，以9g/L氯化钠溶液做空白，于550 nm波长下检测测试菌液的透光率，使测试菌液透光率在60%~ 80%。

19.2样品前处理

19.2.1试样制备

  固体样品粉碎、研磨，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。所有制备后的试样冷藏保存，一周内测定。

19.2.2试样提取

  称一定量的样品（精确至0.000 1 g，样品中含维生素B12为 50 ng~100 ng）于250 mL高压灭菌瓶中，用10 mL的提取溶液混匀后，加150 mL水，摇匀，置于压力灭菌器中121℃水解10 min，冷却后用盐酸溶液（1 mol/L）调pH至4.5±0.2，转入250 mL容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤。移取滤液5mL，加入20 mL~30 mL水，用氢氧化钠溶液（1 mol/L）调pH至6.8±0.2，转入100 mL容量瓶中，定容至刻度，作为试样提取液。

  必要时进一步调整稀释倍数（用f表示） ，使试样提取液中维生素B12的质量浓度在0.01 ng/mL~0.02 ng/mL，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03 mg/ mL。

19.3标准曲线的配制

  按表3分别加入维生素B12标准使用工作液和维生素B12测定用培养基于试管中，一式三份。

19.4待测液的配制

  按表4分别加入水、试样提取液和维生素B12测定用培养基于试管中，一式三份。

19.5 灭菌

  在19.3和19.4中所有需培养的试管内分别加入一粒玻璃珠，盖上试管帽，121℃灭菌5 min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。

19.6 接种

  将灭菌后的试管迅速冷却至30℃以下。除标准曲线管中空白S1管外，用移液器分别向上述试管中加入1滴（约50μL）测试菌液。

19.7 培养

  将试管于36℃±1℃培养19h~20 h。培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，如果S1管出现浑浊，则测定无效，需重做试验。

19.8 测定

19.8.1以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2h后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其透光率。

19.8.2用未接种空白试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100%（或吸光度为0），读出接种空白试管（S2）的读数。再以接种空白试管（S2）为空白，调节透光率为100%（或吸光度为0），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。

19.8.3用涡旋振荡器充分混合每一支试管内培养物（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长550 nm。待读数稳定30 s后，读出透光率，每支试管的稳定时间要相同。各标准曲线浓度点3管吸光度值的相对标准偏差应小于15%。如果3支试管吸光度的相对标准偏差大于或等于15%，则舍去该标准曲线浓度点（舍去的标准曲线浓度点数量不得超过一个）。以标准系列管中维生素B12浓度为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线。

19.8.4根据待测液的透光率，从标准工作曲线中计算该待测液中维生素B12的浓度，根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。透光率超出标准曲线管S3~ S10范围的测试值要舍去。

19.8.5用每支试管的透光率计算每毫升每个编号待测液中维生素B12的浓度，并计算该编号待测液的维生素B12，浓度平均值，每支试管测得的浓度不得招过该平均值的15%超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3，重新计算每一个编号的有效试样管中每毫升测定液中维生素B12含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为ρ。用式（3）计算试样中维生素B12的含量X。

  注：绘制标准曲线，既可读取透光率（T%），也可读取吸光度（A）。

20分析结果的表述

试样中维生素B12（以氰钴胺素计）的含量按式（3）计算：

式中：

X——样品中维生素B12的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；

ρ——有效试样管中维生素B12浓度的总平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

f——样液稀释倍数；

100——换算系数；

m——试样的质量，单位为克（g）。

1000——换算系数。

结果保留两位有效数字。

21精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

22其他

  本方法检出限为0.1 μg/100 g。

  经验证比较确认后，可采用检测体积等比例缩小的微生物微量培养法。