背景介绍

糖代谢是细胞能量合成的主要方式，是维持机体生命活动的基础。在氧气充足的环境中，正常细胞通过葡萄糖氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)途径产能，1mol葡萄糖氧化后可生成36mol ATP。在无氧环境下，葡萄糖经无氧糖酵解代谢转化为乳酸，1mol葡萄糖仅能产生2mol ATP。1927年Warburg先发现肝癌细胞相比其他细胞具有更高的葡萄糖摄取率及增强的糖酵解反应为肿瘤细胞增殖提供主要能量的现象。随后研究发现相较于OXPHOS，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞普遍倾向于有氧糖酵解为其供能，并称这一转变为“Warburg效应”。

有氧糖酵解是在细胞质中进行的，在有氧情况下，1mol葡萄糖被糖酵解代谢为2mol丙酮酸，并获得2mol ATP，而后丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被还原成乳酸，获得另外2mol ATP。虽然单分子葡萄糖的有氧糖酵解产能量低，但其反应步骤少、产能速度高，总产能量大，更加可以满足肿瘤细胞快速增殖的能量需求中。这一现象目前已认为不仅是肿瘤细胞的标志特征之一，增殖细胞及其他体外转化细胞也能够通过有氧糖酵解调整其能量和底物需求以应对不断变化的环境条件^[1]。

抑制糖酵解过程在治疗前列腺癌研究中的应用

2024年2月8日，武汉市中心医院泌尿外科昌磊副主任医师研究团队在Cell Communication and Signaling杂志上发表了题为“1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis”的研究论文。他们的研究表明，P5C通过靶向SHP1/PKM2/LDHB复合体来抑制T细胞的糖酵解过程。研究结果为制备抗P5C抗体提供了机制基础，该抗体可用于恢复T细胞糖酵解和抑制前列腺癌的生长。

图 SHP1、PKM2和LDHB相互结合，P5C抑制T细胞糖酵解^[2]。

注：糖酵解相关生化检测指标：丙酮酸激酶(PK, abs580073)、乳酸(LA, abs580160)、乳酸脱氢酶(LHD, abs580007)

接下来，小爱就以糖酵解系列试剂盒中的丙酮酸激酶检测试剂盒为例，给大家详细介绍使用方法。

丙酮酸激酶检测试剂盒使用方法介绍

一、试剂盒组分

二、操作步骤：

1、材料和试剂准备

自备材料：酶标仪、蒸馏水、移液器与枪头、研钵、离心机、计时器、湿冰等。

Substrate：使用前加入18mL Reaction Buffer溶解。

Enzyme：使用前加入1mL Assay Buffer 溶解。

Standard：使用前加入1mL蒸馏水溶解，然后取0.2mL加入到0.8mL蒸馏水中，获得浓度为400μmol/L的标准品溶液。

Positive Control：使用前加入0.5mL蒸馏水溶解。

2、样本处理

1）细胞/细菌样本：将细胞/细菌(5×10⁶)收集到离心管中，离心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超声处理（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）后于4℃，8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保存待检测；

2）组织样本：称取1g组织，加入1mL Assay buffer在湿冰上匀浆，4℃，8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保存待检测；

3）血清/血浆样本：直接检测。

3、上样及检测

上样前将所有试剂加热至37℃，然后按照如下表格加样。

注：

1）对于标准品，可进行2倍连续稀释（6个点左右），制成标准曲线。

2）对于未知的样品，我们建议挑选几个样品进行预实验，以确定样品浓度和稀释倍数。如果酶活力较低，请向反应体系中加入更多的样品，或增加反应时间；如果酶活力较高，请稀释样品，或减少反应时间。

4、标准曲线

标准曲线仅用于参考，每次实验都必须做一条新的标准曲线。

检测范围：4μmol/L - 400μmol/L

降低浓度的阳性对照示例

常见问题解答

Q1：试剂盒中的96-Well Microplate只有一个，不够实验使用怎么办？

A1：该试剂盒中的96孔板是免费送的，后续实验可以用常规的96孔酶标板代替。

Q2：试剂盒操作说明书中既有标准曲线法又有公式法，我应该选择哪种计算方式？

A2：两种方式任选一种就可以，公式是简便算法，建议按照标曲计算，会更加准确。需要注意的是，使用标准曲线法，每次实验必须重新绘制标准曲线。

Q3：试剂盒中的阳性对照需要和标准曲线一样每次都做吗？

A3：阳性对照不需要每次都做，可以在实验时做以帮助您确认试剂盒是否有问题。当然，也有老师每次做实验都会做阳性对照，以便在实验数据不正常时排查实验哪里出了问题。

[1] 杨柳易,王琛.有氧糖酵解对肾脏疾病影响的研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志, 2022,23(8):744-746.
[2] Chang L, Li G, Jiang S, et al. 1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis[J]. Cell Commun Signal. 2024;22(1):101. Published 2024 Feb 8. doi:10.1186/s12964-024-01493-1

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