中华人民共和国国家标准

GB 31613.4-2022

食品安全国家标准

牛可食性组织中吡利霉素残留量的测定

液相色谱-串联质谱法

National food safety standard-

Determination of pirlimycin residue in bovine edible tissues

by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method

前言

  本文件按照GB/T 1. 1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

  本文件系首次发布。

1范围

  本文件规定了牛可食性组织中吡利霉素残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。

  本文件适用于牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中吡利霉素的残留检测。

2规范性引用文件

  下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

  GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

  本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

  试料中残留的吡利霉素，用5%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，基质匹配标准溶液外标法定量。

5试剂与材料

  除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

5.1 试剂

5.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。

5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱醇。

5. 1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。

5.1.4 无水硫酸钠（Na2SO4）。

5.1.5 氯化钠（NaCl）。

5.2溶液配制

5.2.1 5%甲酸乙腈溶液：取甲酸5mL，用乙腈稀释至100mL。

5.2.2 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1 mL，用乙腈稀释至1 000 mL。

5.2.3 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水稀释至1 000 mL。

5.2.4 80%甲醇溶液：取甲醇80 mL，用水稀释至100 mL。

5.3 标准品

  吡利霉素（Pirlimycin，C17H31ClN2O5S，CAS号：79548-73-5），含量≥99.0%。

5.4标准溶液的制备

5.4.1标准储备液：精密称取吡利霉素标准品约10mg，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的吡利霉素标准储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。

5.4.2 标准中间液：精密量取吡利霉素标准储备液0.1 mL，于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL的吡利霉素标准中间液。2℃~8℃保存，有效期6个月。

5.4.3标准工作液：精密量取吡利霉素标准中间液0.1 mL，于10 mL容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，配制成浓度为100 ng/mL的吡利霉素标准工作液。2℃~8℃保存，有效期6个月。

5.5材料

5.5.1 固相萃取小柱：基质增强脂肪去除柱（300 mg/3 mL），或相当者。

5.5.2 陶瓷均质子。

5.5.3亲水性聚四氟乙烯微孔滤膜：0.22μm。

6仪器和设备

6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。

6.2分析天平：感量0.01 g和0. 0001 g。

6.3涡旋混合器 。

6.4高速离心机。

7试样的制备与保存

7.1试样的制备

  取适量新鲜或解冻的空白或供试样品，绞碎并均质。

a）取均质后的供试样品，作为供试试样；

b）取均质后的空白样品，作为空白试样；

c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。

7.2 试样的保存

  -18℃以下保存。

8测定步骤

8.1 提取

  称取试料2 g（准确至±0.05 g）于50 mL离心管中，加入陶瓷均质子，加入5%甲酸乙腈溶液10 mL， 涡旋30 s，加入无水硫酸钠4 g、氯化钠1 g，涡旋30s，4℃下8000r/ min离心8 min后，快速移取上层乙腈2.4 mL至另一离心管中，加水0.6 mL，混匀，备用。

8.2 净化

  将备用液直接过固相萃取小柱，自然流出，收集滤液，并挤干。取滤液适量过微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

8.3基质匹配标准曲线的制备

  精密量取吡利霉素标准工作液适量，用提取净化后的空白试样溶液稀释成含药物浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL10ng/mL、100ng/mL和400ng/mL的基质匹配系列标准溶液，从中各取1.0mL，过微孔滤膜上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

8.4测定

8.4.1 液相色谱参考条件

a）色谱柱：五氟苯基柱（50 mm×3.0 mm，2.6 μm），或性能相当者。

b）流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0. 1%甲酸乙腈溶液。流动相梯度：0 min~1 min保持10%B；1 min~3 min，10%B线性变化到90%B；3 min~4 min保持90%B；4 min~5 min保持10% B。

c）流速：0.4 mL/min。

d）进样量：5 μL。

e）柱温：30℃。

8.4.2 串联质谱参考条件

a）离子源：电喷雾离子源；

b）扫描方式：正离子扫描；

c）检测方式：多反应离子监测（MRM）；

d）电喷雾电压：5 500 V。

e）离子源温度：500℃。

f）辅助气1：50 psi。

g）辅助气2：50 psi。

h）气帘气：25 psi。

i）碰撞气：Medium。

j）吡利霉素定性、定量离子对和对应的去簇电压、碰撞能量参考值见表1。

8.4.3 测定法

  试样溶液的保留时间在基质匹配标准溶液保留时间的±2.5%之内。试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。

  取基质匹配标准溶液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中吡利霉素的峰面积应在仪器检测的线性范围之内，超出线性范围时进行适当倍数稀释后再进行分析。基质匹配标准溶液中特征离子质量色谱图见附录A中图A.1。

8.5 空白试验

  取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行测定。

9结果计算和表述

试样中吡利霉素的残留量按标准曲线或公式（1）计算。

式中：

X——试样中吡利霉素残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——基质匹配标准溶液中吡利霉素浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

A——试样溶液中吡利霉素的峰面积；

As——基质匹配标准溶液中吡利霉素的峰面积；

V1——提取液总体积的数值，单位为毫升（mL）；

V2——上清液中取出溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；

V3——最终溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；

m——试样质量的数值，单位为克（g）。

10 方法灵敏度、准确度和精密度

10.1灵敏度

  本方法对牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪的检测限为2μg/kg，定量限为10μg/kg。

10.2准确度

  本方法吡利霉素在牛肌肉10μg/kg~200μg/kg、肝脏10μg/kg~2 000μg/kg、肾脏10μg/kg~800μg/kg、脂肪10μg/kg~ 200μg/kg添加浓度上的回收率为60%~110%。

10.3精密度

  本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。