洗涤不充分

 ● 增加洗涤次数

 ● 增加洗液体积

 ● 延长洗涤时间

 ● 确认Tween^® 20 (*)浓度

 无法阻断非特异性结合

 ● 重新调节封闭温度和时间。室温下1 h，4℃下过夜

 ● 添加Tween^® 20 (*)

 ● 使用添加Tween^® 20 (*)的封闭缓冲液（TBS-T、PBS-T）

 ● 使用高灵敏度发光试剂（Immunostar^® 系列）

 膜处理不当

 ● 对膜进行必要的前处理

 ● 使用干净的镊子和手套，注意不要损坏膜。

 ● 孵育时振荡

 ● 使用低背景且可高灵敏度检测靶蛋白的CLEARTRANS^® 系列产品

 因设备、器皿的污垢造成的污染

 ● 充分清洗转膜装置、电泳槽等设备，操作过程中佩戴手套

 强化学发光信号

 ● 缩短检测的曝光时间

 ● 缩短检测试剂的反应时间

 ● 降低检测试剂的浓度

 电压过高发热

 ● 降低电压进行电泳

 盐浓度不同

 ● 盐浓度越高，移动速度越快，需统一样品的盐浓度

 上样量不同

 ● 统一各个孔的上样量

 有空孔

 ● 在空孔中上样相同盐浓度、相同液量的样品，或仅上样样品缓冲液

 样品存放时间久，存储方法不当，

导致蛋白降解

 凝胶和膜之间有气泡

 ● 使用滚筒等去除气泡

 转膜设备的问题

 ● 使用半干式设备时，反复使用会导致转膜板弯曲，建议返厂维修或更换

    新的设备

 转膜方法的问题

 ● 半干式设备容易引起转膜不均匀的问题，可尝试更换为湿转仪

 蛋白量过高

 ● 降低电泳的蛋白量

 抗体浓度高

 ● 降低一抗、二抗的浓度

 检测信号高

 ● 缩短曝光时间

 ● 缩短检测试剂的反应时间，反应后尽可能去除试剂

 ● 降低二抗浓度

 蛋白量高

 ● 减少蛋白量

 抗体浓度高

 ● 降低一抗、二抗的浓度

 抗体失活

 ● 检查抗体存储状态，时间

 ● 重新进行抗体反应时，推荐使用10 min即可去除抗体的“WB膜再生液“

 抗体结合力不足

 ● 确认抗体的稀释浓度是否合适

 ● 延长抗体反应时间

 ● 对于低蛋白表达量的样品，可增加电泳量，提高抗体浓度

 ● 使用抗原抗体反应促进试剂

 ● 更换高效转膜缓冲液

 叠氮-化钠抑制酶反应

 ● 叠氮-化钠会抑制HRP的活性，因此抗体中含叠氮-化钠时，需要稀释抗体

   以降低叠氮-化钠浓度或使用不含叠氮-化钠的抗体

 ● 使用HRP标记一抗且阻断剂中含有叠氮-化钠时，需在封闭后使用 TBS-T

   清洗再进行抗体反应

 曝光时间短

 ● 延长曝光时间

 封闭时间不当

 ● 封闭时间过长时，封闭剂会遮盖抗原，降低抗体反应性，因此需要确认封

   闭时间是否合适

 转膜效率低，无法转膜

 ● 延长转膜时间

 ● 靶蛋白的分子量较高时(例：100   kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫

   酸钠)

● 使用预染蛋白Marker作为阳性对照，确认转膜效率

 ● 使用具有抗体结合位点的分子量Marker作为阳性对照

 检测试剂的化学发光弱

 ● 确认检测试剂是否变质

 ● 使用高灵敏度的发光试剂“ImmunoStar^®系列“

 镊子被污染

 ● 镊子上的污垢会附着在膜上形成背景。需使用经乙醇消毒后的干净镊子

   夹住膜的边缘

 洗涤不充分

● 增加洗涤次数和洗液体积

 抗体反应不当

 ● 增加抗体反应溶液，并振荡使其反应

 检测设备被污染

● 检测前，使用乙醇擦拭放置膜的样品台，去除污垢

 蛋白未转膜

 ● 确认转膜设备是否正确运行

 ● 确认膜和凝胶是否正确接触

 低蛋白量

● 增加蛋白的上样量

 染色试剂变质

 ● 检查染色试剂的有效期

 ● 更换凝胶染色试剂（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、

   Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B）