椎间盘疾病（IVDD）是脊柱退行性疾病之一。由于长时间站立和肥胖导致的椎间盘（IVD）机械超负荷已被广泛认为是 IVDD 的重要原因，而髓核（NP）承担了 75% 的压力。然而，机械超负荷诱导 IVDD 的具体机制尚未阐明。

谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）是主要的脂质过氧化物清除剂，在铁死亡中起着关键的调节作用。据报道，由机械超负荷激活的 Piezo1 离子通道导致的钙内流增强诱导 GPX4-调控的铁死亡。已发现位于内质网膜（ER）的 Piezo1 的激活通过诱导ER的钙离子释放来增加细胞内游离钙。然而，机械超负荷是否会同时激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道以升高 NP  细胞内游离 Ca2+ 的水平，从而导致 GPX4 调控的铁死亡仍有待确定。

硒蛋白K（SelK）是一种ER蛋白，已被证明与内质网应激和细胞抗氧化性有关。硒（Selenium）是一种必需的微量营养素，参与了抗氧化应激的保护。补充硒可以上调各种硒蛋白的表达，并且在滤泡辅助性T细胞中证明了 Selenium-GPX4 轴对铁死亡的保护作用。然而，目前还没有关于补硒是否可以通过上调 NP 细胞中的 SelK 和 GPX4 来减轻铁死亡的报道。

最近，在山东大学齐鲁医院骨科、病理科及美国布莱根妇女医院骨科的一项联合研究中，计划探索机械超负荷是否通过激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道来阻碍 GPX4 的产生，从而导致 NP 细胞中的铁死亡。在上述过程中，研究员将确定促进 ER 应激的因素以及ER应激在铁死亡中的具体作用，此外，将验证补充硒是否可以通过上调 GPX4 和 SelK 来减轻机械超负荷诱导的 NP 细胞铁死亡。研究成果发表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc”。

首先，为了研究 IVDD 期间 NP 组织中铁死亡相关指标的变化，评估了退变椎间盘的 Pfirrmann 分级（图1 A）。与早期阶段相比，晚期退行性椎间盘的 NP 组织体积wei缩，弹性下降（图1 B）。在退行性 NP 组织（IV级）中，GPX4 表达水平降低，但铁死亡生物标志物 ACSL4 的表达水平升高（图1 B）。

为了验证 NP 中过度机械负荷与铁死亡之间的关系，将大鼠 NP 细胞在 1 Hz、1 MPa 机械应力下培养 1 h。微阵列结果表明，与对照组相比，在机械应力刺激下，NP 细胞中 ECM 代谢紊乱，ACSL4 水平增加（图1 C）。GO分析显示，差异表达蛋白与细胞钙离子稳态和对ER应激的反应高度相关，ER 成为zui显著富集的细胞成分之一（图1 D）。对 ER 应激生物标志物 ATF6 进行 IHC，发现与 II 级相比，IV 级 NP 组织中 ATF6 显著增加（图1 E）。

此外，通过 TEM 研究了机械刺激对 NP 细胞的影响。与对照组相比，在机械超负荷组 ER 在结构上表现出异常肿胀，线粒体表现出线粒体膜增厚和线粒体wei缩等铁死亡相关变化（图1 G）。然后，Western blotting 和 qPCR 证实机械刺激降低了GPX4水平，增加了 ACSL4 水平和 ER 应激标志物 Bip 水平（图1 H、I）。通过 GPX4 条件敲除小鼠证明了内源性 GPX4 在 IVD 中的生理作用（图1 J）。

这些数据表明，过度的机械负荷会诱导 NP 细胞的铁死亡和内质网应激。

图1     过度的机械负荷会诱导NP细胞的铁死亡和内质网应激。

接下来，实验使用 SiPiezo1 和无钙培养基来研究铁死亡、ER 应激和机械超负荷之间的关联（图2 A、B）。有趣的是，清除细胞外 Ca2+ 减轻了由机械刺激诱导的细胞内游离 Ca2+ 水平的升高，而 Piezo1 的敲低具有更强的作用（图2 C）。另一方面，Calnexin 水平与细胞内游离 Ca2+ 水平成反比，这表明过度的机械负荷通过 Piezo1 增加了细胞内游离 Ca2+ 水平（图2 C-F）。同样，Piezo1 的敲低减少了由机械刺激的 Bip 的上升，这种效果比仅清除细胞外 Ca2+ 要显著（图2 D-F）。

机械超负荷增加了 NP 细胞中 ROS 的产生并损害了线粒体的膜电位，同时敲低 Piezo1 并清除了细胞外 Ca2+ 逆转了这些变化，但前者更有效（图2 G-J）。敲低 Piezo1 上调了机械刺激诱导的 Col-2 水平的下降，而清除细胞外 Ca2+ 作用较弱（图2 D-F）。

此外，建立 Piezo1-CKO 小鼠阐明 Piezo1 在 ER 应激中的作用。ATF6 免疫组化结果显示，老龄 Piezo1-CKO 小鼠尾椎椎间盘 ER 应激水平显著低于老龄 WT 小鼠（图2 K、K）。在 Piezo1 被 SiPiezo1 敲低后，细胞内游离 Ca2+ 水平的升高被显著逆转，表明 Piezo1 的作用。

这些数据表明，机械超负荷通过位于 NP 细胞质膜和 ER 膜上的 Piezo1 离子通道来增加细胞内游离 Ca2+ 水平以诱导 ER 应激和铁死亡。

据报道，抑制ER应激可以减轻结肠上皮细胞的铁死亡，研究发现，Ca2+ 可能是 ER 应激和铁死亡之间的关键节点。因此，利用 Ca2+-free 培养基和 ER 应激抑制剂 Bip 诱导因子X （BIX）进一步探讨了 ER 应激、铁死亡与细胞内游离 Ca2+ 之间的关联。数据显示，BIX 上调了 Bip 的水平，从而改善了 ER 应激并进一步降低了 ER 应激生物标志物 PERK 的水平，且细胞内游离 Ca2+ 的水平也降低。相应地，观察到 Calnexin 水平与细胞内游离 Ca2+ 成反比，ACSL4 与之呈正比，GPX4 与之呈反比。此外，抑制ER应激进一步降低了 ROS 合成的升高，缓解了线粒体功能障碍，减少 ECM 分解代谢生物标志物 MMP-13 的产生，并促进 ECM 合成代谢生物标志物 Col-2 的分泌。这些数据表明，抑制ER应激通过减轻从 ER 流出的 Ca2+ 来减弱机械超负荷诱导的铁死亡。

图2    机械超负荷通过位于 NP 细胞质膜和 ER 膜上的 Piezo1 离子通道来增加细胞内游离 Ca2+ 水平以诱导 ER 应激和铁死亡。

进一步的，实验收集了不同等级的人类 NP 组织，并检测了selenium 的浓度，发现退行性 NP 组织（IV级）中其浓度降低（图3 A）。此外，在 500 kPa 或 1 MPa 的机械应力下培养大鼠 NP 细胞，无论是否添加 Se-Met，高应变负荷降低了 selenium 的浓度，但补充 Se-Met 逆转了这种变化（图3 B）。补充 Se-Met 还改善了 ECM 代谢紊乱，促进了细胞对钙离子和 ER 应激的反应（图3 C、D），并改善机械超负荷引起的 ER 肿胀和线粒体wei缩（图3 E）。qPCR 和 Western blotting 显示，高应变负荷降低了 GPX4 mRNA 和蛋白水平，而补充 Se-Met 促进了 GPX4 的表达（图3 F、G）。Se-Met 还改善了机械超负荷诱导的 ROS 合成升高和线粒体功能障碍，并促进 Col-2 的表达，但当额外应用 GPX4 抑制剂 ML210 时，无法再观察到这种现象（图3 H、I、J）。Se-Met 还可减少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的产生，促进 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而 ML210 则加重了 ECM 代谢紊乱（图3 K-M）。这些数据表明，补充 Selenium 通过增强 GPX4 表达来保护 NP 细胞免受铁死亡的影响。

为了探索 SelK 在机械超负荷诱导的 ER 应激中的作用，在大鼠 NP 细胞中敲低 SelK，添加 Se-Met，并对 NP 细胞进行机械超负荷刺激。qPCR 和 Western blotting 显示，补充 Se-Met 组的 SelK 表达上调，ATF6 和 PERK 降低，而补充 Se-Met 的 SelK 敲低组则没有出现这些结果。Se-Met 组的 GPX4 表达最高，ROS 合成减少，线粒体功能障碍得到改善，而 SelK 敲低后效果消失。此外，补充 Se-Met 可减少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的产生，促进 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而敲低 SelK 会加重 ECM 代谢紊乱。这些数据表明，补充 Selenium 通过上调 SELK 表达来减轻 ER 应激。

图3    补充Selenium通过增强 GPX4 表达来保护 NP 细胞免受铁死亡的影响。

最后，使用 WT 和 GPX4-CKO 小鼠来验证 Selenium 在体内的作用，在12周龄的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中建立 IVDD 模型（图4 A、B），收集小鼠的尾骨椎间盘组织，检测  Selenium 的浓度。有趣的是，针刺降低了 Selenium 的浓度，但补充 Se-Met 改善了这种变化，但这种效果在 GPX4-CKO 小鼠中减弱（图4 C）。MRI和显微CT显示，Se-Met 可缓解 WT 小鼠针刺诱导的 IVDD，然而，通过补充 Selenium，GPX4-CKO 小鼠的 IVDD 表型并未得到改善（图4 D、E）。免疫组化染色显示，补充 Se-Met 的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中 SelK 表达增加，ATF6 降低（图4 F、G）。此外，在补充 Se-Met 的 WT 小鼠中观察到 Col-2 的表达增加和 MMP-13 的表达降低，但在 GPX4-CKO 小鼠中没有观察到（图4 F、G），这提示 GPX4 是 Se-Met 起作用的关键节点。这些数据表明，补充 Selenium 可缓解小鼠 IVDD 的进展。

图4     补充硒可减轻小鼠IVDD的进展。

图5    Selenium-SelK-GPX4 轴保护髓核细胞免受机械超负荷诱导的铁死亡的示意图。

综上所述，该研究表明，在 NP 细胞中，当位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道被机械超负荷激活时，细胞外钙内流和细胞内钙外流加强，导致细胞内钙超载，从而导致 ER 应激，进一步加剧 ER 钙外流，进而阻碍 GPX4 的产生和功能，诱导铁死亡和 ECM 代谢紊乱。然而，补充 Selenium 可以上调 SelK 表达，缓解内质网应激，增强 GPX4 表达，减弱细胞氧化应激和铁死亡。总之，铁死亡在机械超负荷诱导的 IVDD 中起重要作用，补充 Selenium 对减轻铁死亡，从而缓解 IVDD 具有重要意义，这可能为 IVDD 的潜在治疗干预提供见解。

参考文献：Jia C, Xiang Z, Zhang P, Liu L, Zhu X, Yu R, Liu Z, Wang S, Liu K, Wang Z, Vasilev K, Zhou S, Geng Z, Liu X, Zhao Y, Gao Y, Cheng L, Li Y. Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc. Cell Mol Life Sci. 2024 Jan 22;81(1)49. doi 10.1007s00018-023-05067-1. PMID 38252317; PMCID PMC10803455.

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