中华人民共和国国家标准

GB/T 19427-2022

代替GB/T 19427-2003

蜂胶中 12 种酚类化合物含量的测定

液相色谱-串联质谱法和液相色谱法

Determination of 12 phenolic compounds in propolis-

HPLC-MS/MS method and HPLC method

前言

  本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

  本文件代替GB/T 19427-2003《蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法液相色谱-串联质谱检测法和液相色谱紫外检测法》，与GB/T 19427-2003相比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术变化如下：

  a）增加了咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C检测项目（见第1章、5.11.7.2）；

  b）删除了芦丁、杨梅酮检测项目（见2003年版的第1章，4.4、4.5、4.6、6.2）；

  c）更改了蜂胶样品提取条件（见7.1，2003年版的6.1）。

  本文件由中华全国供销合作总社提出。

  本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG 2）归口。

  本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、浙江大学、厦门思健生物科技有限公司。

  本文件主要起草人：李学民、胡福良、崔宗岩、张翠平、李响、杨志伟、曹翠玲、刘晓茂、贾光群、张进杰、曹彦忠、颜鉴翔。

  本文件所代替文件的历次版本发布情况为：

  ——GB/T 19427-2003。

1范围

  本文件描述了蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量测定的液相色谱串联质谱法和液相色谱法。

  本文件适用于蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量的测定。

2规范性引用文件

  下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

  GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

  本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

  蜂胶试样用85%乙醇水溶液提取，超声、离心、过滤和定容后，液相色谱串联质谱仪测定或配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。

5试剂和材料

  除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1乙醇：无水乙醇。

5.2甲醇：色谱纯。

5.3甲酸：色谱纯。

5.4乙酸：色谱纯。

5.5 乙醇水溶液（85+15）：准确移取85 mL乙醇（5.1）至100 mL容量瓶中，用水定容。

5.6甲醇水溶液（80+20）：准确移取80 mL甲醇（5.2）至100 mL容量瓶中，用水定容。

5.7甲醇-0.1%甲酸水溶液（50+50）：准确移取50 mL甲醇（5.2）以及0.1 mL甲酸（5.3）至100 mL，容量瓶中，用水定容。

5.8 0.1%甲酸水溶液：准确移取1.0 mL甲酸（5.3）至1 000 mL容量瓶中，用水定容。

5.9 0.1%甲酸-甲醇溶液：准确移取1.0 mL甲酸（5.3）至1 000 mL容量瓶中，用甲醇（5.2）定容。

5.10 1.0%乙 酸水溶液：准确移取10 mL乙酸（5.4）至1 000 mL.容量瓶中，用水定容。

5.11标准物质：绿原酸（CAS号：327-97-9）、咖啡酸（CAS号：331-39-5）、p-香豆酸（CAS号：501-98-4）、阿魏酸（CAS号：1135-24-6）、槲皮素（CAS号：117-39-5）、莰菲醇（CAS号：520-18-3）、芹菜素（CAS号：520-36-5）、松属素（CAS号：480-39-7）、短叶松素3-乙酸酯（CAS号：52117-69-8）、柯因（CAS号：480-40-0）、高良姜素（CAS号：548 -83-4）和阿替匹林C（CAS号：72944-19-5） ，纯度均不低于98%。

5.12标准储备液：准确称取适量的标准物质（5.11），分别用甲醇（5.2）制备浓度为1.0mg/mL的标准储备液，该储备液在-18℃及以下温度可稳定保存6个月。

5.13标准工作溶液：移取适量的标准储备液（5.12），用甲醇-0.1%甲酸水溶液（5.7）稀释成浓度为0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱法检测使用；移取适量的标准储备液（5.12），用甲醇水溶液（5.6）分别稀释成浓度为1.0μg/mL、2.0μg/ mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液相色谱-紫外检测法检测使用。

6仪器和设备

6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。

6.2液相色谱仪：配有紫外（或二极管阵列）检测器。

6.3分析天平：感量0.01 mg和0.001 g。

6.4超声波清洗仪。

6.5离心机：转速不低于4 000 r/min。

6.6微量可调移液器：量程分别为10μL~ 100 μL和0.1 mL~1 mL。

6.7 微孔滤膜：0.22 μm。

7分析步骤

7.1 试样的制备与处理

7.1.1 试样的制备

  取混合均匀的代表性蜂胶样品约100 g，密封，并做标记。在样品测定前，将被测样品放入10℃以下冰箱中保持2 h后，取出20 g~30 g，迅速用粉碎机粉碎，过孔径约为2 mm（10目）的筛，冷藏保存于冰箱中作为待测试样。

7.1.2试 样的处理

  称取0.5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL.塑料离心管中，加15 mL乙醇水溶液（5.5），在室温超声提取20min，在4000r/min下离心10min，上清液转入50mL容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心2次，合并上清液，用乙醇水溶液（5.5）定容至50 mL，混匀。取上述样品溶液用甲醇水溶液（5.6）适当稀释并混匀后，取部分溶液过0.22 μm微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱仪（6.2）测定；或取上述样品溶液用甲醇-0.1%甲酸水溶液（5.7）适当稀释后，过0.22μm微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪（6.1）测定。

7.2测定

7.2.1液相色谱-串联质谱参考条件

液相色谱申联质谱仪的液相色谱参考条件如下：

a）色谱柱：C18，100 mm×2.1 mm；1.7μm或相当者；

b）流动相A：0.1%甲酸水溶液（5.8）；

c）流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液（5.9），梯度洗脱条件参见附录A的表A.1；

d）流速：0.25 mL/min；

e）柱温：30℃；

f）进样体积：2 μL。

液相色谱-串联质谱仪的质谱参考条件如下：

a）扫描方式：正负离子扫描；

b）检测方式：多离子反应监测（MRM）；

c）电喷雾电压：+5 500 V/-4 500 V；

d）雾化气体气压：0.345 MPa；

e）气帘气压：0.172 MPa；

f）离子源温度：500℃；

g）去簇电压：+100 V/-100 V；

h）定量离子对、定性离子对和碰撞能量：参见表1。

7.2.2 液相色谱参考条件

液相色谱仪（6.2）的参考条件如下：

a）色谱柱：C18，150 mm×4.6 mm；3.0 μm或相当者：

b）流动相A：1.0%乙酸水溶液（5.10）；

c）流动相B：甲醇（5.2），梯度洗脱条件参见表A.2；

d）流速：1.0 mL/min；

e）柱温：35℃；

f）进样体积：5μL；

g）检测波长：12种酚类化合物的定量检测波长参见表1。

7.2.3定 性与定量测定

7.2.3.1液相色谱-串联质谱法.

  按7.2.1中液相色谱-串联质谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液（5.13）。如果样品溶液与标准工作溶液在相同的保留时间有峰出现（保留时间偏差不超过±2.5%），且在扣除背景后的样品谱图中，所选择离子全部出现，其离子的丰度与标准物质对应的离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表2的规定范围，可判定样品中存在被测物。以标准工作溶液浓度为横坐标，以12种酚类化合物定量离子峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。样品溶液中12种酚类化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。12种酚类化合物的多反应监测（MRM）色谱图和保留时间参见附录B的图B.1。

7.2.3.2 液相色谱法

  按7.2.2中液相色谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液。如果样品溶液与混合标准工作溶液在相同的保留时间有峰出现（保留时间偏差不超过±2.5%），可判定样品中存在被测物。以标准i工作溶波浓度为横坐标，以定量检测波长下12种酚类化合物峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。

  样品溶液中12种酚类化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。12种酚类化合物标准物质的色谱图和保留时间参见图B.2。

7.3平行试验

  同一样品应按照7.1和7.2进行平行测试。

7.4空白试验

  不称取试样，其余均按照7.1和7.2进行。

8结果计算

  某一种酚类化合物在试样中的含量用色谱数据处理系统或用式（1）计算：

式中：

——试样中酚类化合物含量，单位为克每千克（g/kg）；

——从标准工作曲线得到的试样溶液中各目标物质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

——试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；

——最终试样溶液所代表的试样质量.单位为克（g）。

计算结果保留三位有效数字。

9定量限

  本文件液相色谱-串联质谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素和阿替匹林C均为0.02 μg/mL；按照1：10 000稀释倍数计算，方法对于实际样品中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林C定量限均为0.20 g/kg。

  本文件液相色谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、加香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林C均为1.0μg/mL；按照1：100 稀释倍数计算.方法对于实际样品中绿原酸、咖啡酸、力一香豆酸、阿魏酸、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林C定量限均为0.10g/kg。

10 精密度

  平行试验两次测定的绝对差值不超过其算术平均值的10%。