一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量测定试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NO  (Nitric Oxide ，NO) 广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统 中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是 一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。

测定原理：

NO在体内或水溶液中极易氧化生成 NO2-，在酸性条件下，NO2-与重氮盐磺酸胺生成重氮 化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以 计算NO含量。为了排除样品色素等的影响，每个样品需做对照管。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96  孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1  瓶，4℃保存。

试剂一：液体 3mL×1  瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体 3mL×1  瓶，4℃保存。

试剂三：液体 6mL×1  瓶，4℃避光保存。

样品处理：

1.  组织：按照组织质量 (g) ：提取液体积(mL)为1：5~ 10的比例 (建议称取约0. 1g组织，加入 1mL提取液) 进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 15min ，取上清，置冰上待测。

2.  细菌、真菌：按照细胞数量 (104个) ：提取液体积 (mL) 为500~ 1000：1的比例 (建议500 万细胞加入1mL提取液) ，冰浴超声波破碎细胞 (功率300w ，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min ) ；然后10000g ，4℃ ，离心 15min ，取上清置于冰上待测。

3.  体液和培养液等其它液态样品：直接测定。

测定步骤和操作表：

1 、  分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至550nm。

2 、  操作表

NO  含量计算：

a.    用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.016x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、组织样品：

NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相当于1μmoL NO。

(1) 按样本质量计算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反总÷  (V  样÷V  样总×W) ×10 -3

= 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷W

(2) 按样本蛋白浓度计算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550 +0.0103) ÷0.016×V  反总÷  (V  样×Cpr) ×10 -3 = 0. 125×  (A 550 +0.0103) ÷Cpr

2 、其他样品：

NO  含量定义：25℃时，每升样品15min生成 1μmoL NO2- ，相当于1μmoL NO。 NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550+0.0103) ÷0.016×V  反总÷V  样

= 125×  (A 550+0.0103)

V  反总：反应总体积，0.2mL；V  样：反应中样品体积，0. 1mL；V  样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

b.  用 96  孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.008x-0.0103 ，R2=0. 9986

1 、组织样品：

NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相当于1μmoL NO。 (1) 按样本重量计算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008×V  反总÷  (V  样÷V  样总×W) ×10 -3

= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷W

(2) 按样本蛋白浓度计算

NO  含量 (μmoL/mg prot) =  (A 550+0.0103) ÷0.008×V  反总÷  (V  样×Cpr) ×10 -3 = 0.25×  (A 550+0.0103) ÷ Cpr

2 、细胞

NO  含量定义：25℃时，每104个细胞15min  生成 1μmoL NO2- ，相当于1μmoL NO。

NO  含量 (μmol/104cell) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V反总÷ (V样÷V样总×细胞数量) ×10 -3= 0.25×  (A 550+0.0103) ÷细胞数量 (万个)

3 、  其他样品：

NO  含量定义：25℃时，每升样品 15min  生成 1μmoL NO2- ，相当于1μmoL NO。

NO  含量 (μmoL/L) =  (A 550 +0.0103) ÷0.008× V  反总÷V  样= 250×  (A 550 +0.0103)   V  反总：反应总体积，0.2mL；V  样：反应中样品体积，0. 1mL；V  样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

注意事项：

1.  试剂盒 2-8℃保存。

2.  尽量使用新鲜样品进行检测，试剂三有腐蚀性，操作时请做好防护措施。

3.  若检测出得 OD  值在标准曲线范围外，请将样品进行适当的浓缩或稀释，并在计算公式 中除以浓缩倍数或者乘以稀释倍数。

4.  最DI检出限为 0.65μmoL/L。

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