正畸牙齿移动（OTM）期间产生的机械刺激包括拉伸和压缩应变，它们触发牙周膜成纤维细胞（PdLFs）的力特异性机械生物学反应，为组织和骨重塑创造有利的微环境。拉伸力通过增加抗炎 IL-10 的分泌和刺激成骨细胞分化来促进骨形成。由于 PdL 成纤维细胞分化为成骨细胞的内在潜力，在施加拉力时检测到碱性磷酸酶（ALP）和 runt 相关转录因子2（RUNX2）等成骨标志物的表达以及钙沉积物的增加。相反，压缩力通过 PdLFs 诱导缺氧和促炎细胞因子，包括 IL-6、IL-8、PGE2 以及 RANKL 的分泌来促进骨吸收微环境。

作为一种应激响应型多功能调节因子，最近发现生长分化因子15（GDF15）在 PdLFs 对压缩力的机械反应中是重要的促炎调节剂。细胞外 GDF15 可以与细胞膜受体结合，此外，激活素受体样激酶（ALK）家族的成员也结合 GDF15 并介导自分泌和旁分泌功能。除了其受体介导的信号转导外，据报道，未经处理的 GDF15 在易位到细胞核后也能调节基因表达。

考虑到 GDF15 在 PdL 成纤维细胞机械反应中的关键作用，长期暴露于 GDF15 可能会损害其功能，从而增加这些患者在正畸治疗中的风险。GDF15 已被证明可以调节成骨细胞的分化和功能，从而可能改变细胞命运和 PdLFs 的机械反应，这之间似乎特别相关。因此，德国耶拿大学附属医院口腔正畸科的研究员在一项实验中探讨了长时间暴露于 GDF15 对 PdL 成纤维细胞特性和机械生物学功能的影响。研究成果发表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊题为“GDF15 Promotes the Osteogenic Cell Fate of Periodontal Ligament Fibroblasts, thus Affecting Their Mechanobiological Response”。

首先，为了评估长时间暴露于 GDF15 对 hPdLFs 的影响，分析了两种浓度的重组人 GDF15（rhGDF15：5 ng/mL；20 ng/mL）刺激 12、24 和 36 天后的代谢活性（图1 d），发现 12 天的刺激导致代谢活性降低，这种降低随着刺激时间的延长而持续。

随后确定细胞密度（图1 e、f），刺激 12 天后，细胞密度显著降低，且随着暴露时间的增加而变得更加明显，但与应用的 rhGDF15 浓度无关。为了确定增殖细胞的比例，在 rhGDF15 暴露 12、24 和 36 天后对增殖标志物 Ki-67 进行免疫荧光染色（图1 e、g）。在所有条件下，观察到 Ki67 阳性细胞的比例降低，这可能是由于空间有限导致生长衰老或诱导的分化程序。在任何分析的时间点均未检测到所应用的两种 rhGDF15 浓度之间的显著差异。

由于 GDF15 被报道会影响细胞存活，因此还使用台盼蓝染色（图1h）TUNEL 测定法（图1 i、j）分析了受损细胞的比例。然而，既没有检测到与培养持续时间相关的细胞存活变化，也没有检测到由暴露于 rhGDF15 引起的变化。

这些数据表明，GDF15 限制了 hPdLFs 的增殖能力，而不影响细胞存活。

图1     GDF15限制hPdLFs的细胞增殖，但不影响细胞的长期存活。

由于细胞存活不受影响，hPdLFs 增殖减少可能是由细胞衰老或成骨分化增加引起的，这两者都可能受到 GDF15 的影响。对早期衰老标志物 p21 的免疫荧光染色强度进行定量分析显示，在两种浓度 rhGDF15 刺激 12 天和 24 天后，其表达水平显著升高，在刺激的最高时间点无法检测到这种增加。这表明，rhGDF15 刺激 12 天后，细胞衰老激活增强，而长时间暴露后没有观察到显著变化。

接下来，实验旨在解决 GDF15 的成骨分化和潜在改变，这可能是除衰老外，刺激 hPdLFs 增殖能力降低的重要因素。对成骨标志基因 ALPL 和 RUNX2 进行定量表达分析，结果显示，其在 rhGDF15 暴露 12 天和 24 天后水平升高（图2 a、b）。作为成骨分化特征的碱性磷酸酶活性的进一步分析清楚地表明，其在 rhGDF15 暴露 36 天后水平升高（图2 c、d）。值得注意的是，RNA 转录水平不一定与各自的蛋白质水平相关，翻译后调控可能还会额外调节蛋白质活性。

考虑到 ALP 活性对矿化至关重要，研究员进一步分析了钙沉积的形成，作为 rhGDF15 刺激 36 天时成骨细胞活性的标志物（图2 e、f）。结果观察到，在 rhGDF15 的长期刺激下，矿化沉积物的形成略有增加，但似乎也与浓度无关，然而，在成骨分化对照中这一增幅明显更高。

这些数据表明，GDF15 在长期暴露后促进 hPdLFs 的成骨分化，而细胞衰老随着刺激时间的缩短而更加突出。

图2      长期暴露于GDF15可促进hPdLFs的成骨分化。

在后续研究中，实验旨在确定通过 36 天的长时间 rhGDF15 暴露向成骨细胞命运的转变在多大程度上影响了对机械刺激做出反应的 hPdLFs 的功能。为此，应用双轴拉伸力（15.9%），抗炎标志物IL-10（图3 a）和 IL-1RA （图3 b）水平升高，并没有因先前长期暴露于 rhGDF15 而产生相关的变化。然后分析贴壁THP1细胞，通过确定单核免疫细胞的激活来可视化炎症反应（图3 c、d），发现虽然拉伸力促进了抗炎反应，减少了 THP1 的激活，但先前的 rhGDF15 暴露阻断了这种反应。

由于骨形成和成骨细胞活性的激活是拉伸部位的关键特征，因此进一步分析了双轴拉伸应力 24 h 后 hPdLFs 中 ALP 活性的诱导（图3 e、f）。虽然对照组由于施加拉伸力而显示出增加的 ALP 活性，但在 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中没有检测到这一点，这表明拉伸应力对进一步成骨细胞的激活有限。值得注意的是，由于基线水平增加，rhGDF15 暴露下拉伸刺激的 hPdLFs 中的 ALP 活性仍显著高于应力对照细胞（图3 f）。此外，还研究了施加拉伸应力后钙沉积的形成（图3 g、h）。虽然先前检测到的 GDF15-依赖性钙沉积形成的增加在力应激细胞中也被检测到，但与未刺激的hPdLFs相比，对照培养组和 rhGDF15-刺激的 hPdLFs 组都没有显示出与拉伸力相关的差异。

图3   长期暴露于 GDF15 的 hPdLFs 显示出对拉伸应力的抗炎和促成骨机械反应降低。

基于其在调节对压缩刺激的促炎反应中的关键作用，最后，实验研究了先前的长期暴露对压缩应力（2 g/cm2）下 hPdLFs 机械反应的影响。压缩力促进 hPdLFs 的促炎反应，并通过增加 RANKL 水平和激活破骨细胞来促进骨降解。

对促炎细胞因子 IL-6 和 COX2（图4 a、b）进行定量分析，虽然没有检测到 GDF15 依赖性的 COX2 表达，但在压缩力下的 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中 IL6 水平显著增加。值得注意的是，基线水平不会随着 rhGDF15 暴露而改变。为了研究 IL6 表达的变化是否也会导致炎症反应的改变，从而导致免疫细胞的激活，研究相应地分析了 THP1 单核细胞的粘附（图4 c、d），发现 rhGDF15 长期刺激期间压缩力刺激的 hPdLFs 对单核细胞的激活增加。

通过分析应力刺激下的 hPdLFs 的 RANKL 和 OPG 表达，重点关注对骨吸收破骨细胞激活的可能影响（图4 e、f）。在对照组中，压缩力促进了 RANKL 水平的显著增加和 OPG 水平的显著降低，在这种情况下，通常通过增加 RANKL-RANK 结合来促进破骨细胞分化。然而，在 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中没有观察到这些变化。

为了进一步解决破骨细胞激活在功能上的变化，将预刺激的THP1单核细胞产生的巨噬细胞用压缩应力刺激的 hPdLFs 的培养上清液培养（图4 f、g）。与未受压缩应力的对照组相比，压缩对照成纤维细胞的培养基上清刺激后，检测到向单核前破骨细胞和成熟多核破骨细胞的分化增强。然而，与 RANKL 和 OPG 表达数据一致，在广泛暴露于 rhGDF15 的压缩 hPdLFs 中观察到破骨细胞活化减少。

这些数据表明，GDF15 的长期刺激对人 PdL 成纤维细胞的细胞特性和促炎机械生物学反应具有相关影响，导致由于压缩力诱导的炎症增加，但破骨细胞活化减少，可能是通过调节 RANKL/OPG。

图4     长期暴露于 GDF15 的 hPdLFs 对压缩刺激的促炎反应增加，对破骨细胞的激活有限。

总之，该研究结果强烈表明，GDF15 对 PdL 成纤维细胞的细胞命运具有相关影响，从而在较长的时间内促进成骨分化。此外，GDF15 似乎影响这些细胞的力相关炎症机械反应，并随后影响它们对破骨细胞的激活。由于研究使用简化的体外加载模型来模拟具有压缩和拉伸应变的正畸牙齿移动，因此未来的研究应侧重于体内的这些发现。总而言之，以上研究提供了证据表明，长期升高的 GDF15 水平（例如与特定疾病和衰老相关的水平）确实会影响 PdL 细胞的机械反应性，因此可能与这些患者的正畸治疗有关。

参考文献：Lösch L, Stemmler A, Fischer A, Steinmetz J, Schuldt L, Hennig CL, Symmank J, Jacobs C. GDF15 Promotes the Osteogenic Cell Fate of Periodontal Ligament Fibroblasts, thus Affecting Their Mechanobiological Response. Int J Mol Sci. 2023 Jun 11;24(12):10011. doi: 10.3390/ijms241210011. PMID: 37373159; PMCID: PMC10298702.

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