今天想给大家介绍另一种分泌型细胞因子的检测方法，也就是ELISPOT技术，它是目前用于细胞因子检测灵敏的实验方法。

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Enzyme-linked Immunospot Assay，即ELISPOT，全名为酶联免疫斑点检测。该技术同时结合了细胞培养技术和酶联免疫吸附技术（ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况（ELISPOT实际上是双夹心ELISA的延伸和发展，可以看作单细胞水平的ELISA）。该技术的优点在于：①灵敏度高，较传统ELISA灵敏度高2-3个数量级；②单细胞水平评价活细胞功能；③操作简单，可进行高通量筛选。

ELISPOT常见的应用领域包括：T/B细胞功能研究、自身免疫检测、yizhi、疫苗和药品的研发与检测、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等。ELISPOT技术最初用于B淋巴细胞分泌抗体的检测。由于B细胞分泌的抗体量一般较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测灵敏度不高，但是用于抗体检测还是绰绰有余。后面随着技术的进步，ELISPOT检测的灵敏度越来越高，因此被更多地用于痕量细胞因子的检测。ELISPOT用于T细胞功能评价时，能够区分活化的T细胞亚群，例如，Th1细胞产生IFN-γ、IL-2和TNF-α，Th2细胞产生IL-4、IL-5和IL-13等。目前利用ELISPOT检测T细胞分泌IFN-γ的实验已经得到非常广泛的应用，尤其在疫苗有效性评价中具有重要意义，原因：① IFN-γ与CD8 T细胞的溶细胞活性密切相关；② CD4 T细胞参与的细胞毒性免疫反应会产生IFN-γ。

02

ELISPOT实验原理

ELISPOT实验原理如图1：

a：ELISPOT 实验在96孔板上进行，使用 PVDF 膜作为基质，膜上包被特异性的单克隆抗体（抗体须无毒，不含内毒素，亲和力高），以捕获细胞分泌的细胞因子。

b：待测细胞和刺激物（抗原或丝裂原）在板内进行共培养，此时待测细胞分泌的细胞因子能够被包被在膜上的抗体特异性地捕获。

c：去除细胞后，加入生物素标记的二抗，可与被捕获的细胞因子相结合。

d：然后加入酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色反应，此时可以在膜的局部形成一个个圆形斑点e，一个斑点对应当初一个分泌细胞因子的细胞。

e：特异性抗原再刺激引流淋巴结细胞9天进行小鼠IFN-γ ELISPOT检测结果。

阳性细胞率%=膜斑点数/加入孔内的细胞总数×100%

图1 ELISPOT技术检测原理[1]

注：也可以直接使用荧光素标记二抗与细胞因子进行结合反应，此时不再需要进行化学发光显色，可以一次检测多种细胞因子。但是作为膜板材质的NC膜和PVDF膜具有自发荧光的问题，会造成检测结果背景升高。

实验所使用的的配对抗体对于斑点形成的灵敏度具有重要影响，以下两图列出了小鼠和人进行细胞因子ELISPOT实验文献中推荐使用的配对抗体。抗体可以从多种商业途径获得，包括eBiosciences、Biolegend、BD Biosciences和Thermo Scientific等。

图2 小鼠细胞因子ELISPOT实验推荐使用的配对抗体[1]

图3 人细胞因子ELISPOT实验推荐使用的配对抗体[1]

以下过程1（抗原包被）和2（细胞培养）必须在无菌条件下进行，过程3（细胞因子检测）在常规条件下操作即可。我们也可以用ELISPOT实验检测分泌特异性抗体的B细胞，该过程的原理和步骤与细胞因子ELISPOT测定相同，不同之处在于需要使用特异性抗原（例如肽或蛋白质，1-20 μg/mL）而非抗体包被ELISPOT板。

（1）准备无菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室温孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，经常使用的是硝酸纤维素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我们进行WB实验常用的两种蛋白结合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更优的蛋白吸附性能，更精细的显色条带分辨率。但是由于疏水性问题，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增强其蛋白结合能力（润湿后PVDF膜由洁白不透明变成暗色半透明状）。

（2）弃乙醇溶液，每孔以200 μL无菌PBS洗涤3次，尽量减少乙醇残留。

注：本实验所用的所有PBS溶液均不含钙、镁离子。在进行移液操作时，移液枪应沿着孔壁接近孔底的地方加入，不能直接对着膜垂直加入或者触碰到膜，减少膜可能的破损。此外，若在高压/高速下往孔中添加或移除溶液，可能导致孔的背景颜色不均匀。因此后面在洗涤膜板时，通常是将膜板浸入水中而不是直接利用流动的水进行冲洗。

（3）96孔板每孔加入抗体溶液50 μL（无菌PBS稀释至适宜浓度），盖上板盖置于湿盒中（可减少抗体溶液挥发），4℃包被过夜。

注：内毒素对ELISPOT实验的结果会产生很大的影响，即使是微量的内毒素也能非特异性刺激T淋巴细胞，促进细胞因子的分泌。实验中内毒素的来源主要是各种试剂。此外，血清除了含有内毒素之外还可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影响最终斑点的形成，使用无血清ELISPOT技术可以避免其影响。文献[1]在培养小鼠细胞时使用的是HL-1培养基，培养人细胞时使用的是CTL-Test培养基。

以下过程1（抗原包被）和2（细胞培养）必须在无菌条件下进行，过程3（细胞因子检测）在常规条件下操作即可。我们也可以用ELISPOT实验检测分泌特异性抗体的B细胞，该过程的原理和步骤与细胞因子ELISPOT测定相同，不同之处在于需要使用特异性抗原（例如肽或蛋白质，1-20 μg/mL）而非抗体包被ELISPOT板。

（1）准备无菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室温孵育30 s。

注：在PVDF膜之前，经常使用的是硝酸纤维素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我们进行WB实验常用的两种蛋白结合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更优的蛋白吸附性能，更精细的显色条带分辨率。但是由于疏水性问题，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增强其蛋白结合能力（润湿后PVDF膜由洁白不透明变成暗色半透明状）。

（2）弃乙醇溶液，每孔以200 μL无菌PBS洗涤3次，尽量减少乙醇残留。

注：本实验所用的所有PBS溶液均不含钙、镁离子。在进行移液操作时，移液枪应沿着孔壁接近孔底的地方加入，不能直接对着膜垂直加入或者触碰到膜，减少膜可能的破损。此外，若在高压/高速下往孔中添加或移除溶液，可能导致孔的背景颜色不均匀。因此后面在洗涤膜板时，通常是将膜板浸入水中而不是直接利用流动的水进行冲洗。

（3）96孔板每孔加入抗体溶液50 μL（无菌PBS稀释至适宜浓度），盖上板盖置于湿盒中（可减少抗体溶液挥发），4℃包被过夜。

注：内毒素对ELISPOT实验的结果会产生很大的影响，即使是微量的内毒素也能非特异性刺激T淋巴细胞，促进细胞因子的分泌。实验中内毒素的来源主要是各种试剂。此外，血清除了含有内毒素之外还可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影响最终斑点的形成，使用无血清ELISPOT技术可以避免其影响。文献[1]在培养小鼠细胞时使用的是HL-1培养基，培养人细胞时使用的是CTL-Test培养基。

图4 ELISPOT实验过程总览[2]

（3）弃去封闭液，每孔以200 μL无菌PBS洗涤1次，轻轻在无菌吸水纸上扣干。（膜板不用时可在4℃保存数周）

注：后续若是使用的是过往封闭的膜板，每孔可以加入200 μL细胞培养基于室温下静置10 min。弃培养基后，重复该操作一次，再弃培养基，扣干后进行后续实验操作。

（4）组别设计：① 阴性对照孔：100 μL培养基+100 μL细胞；② 细胞样品孔：100 μL培养基稀释的适宜浓度刺激物+100 μL细胞；③ 阳性对照：100 μL阳性对照刺激物+100 μL细胞（常用阳性对照刺激物类型及浓度见文末附1和2）；④背景对照孔：不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂。

注1：细胞加入之后，不宜再震动或拍击ELISPOT板，震动或拍击反而会促进细胞成圈分布在孔的外周。同时ELISPOT板之间不能叠放，叠放会引起整块板温度不均匀，导致四周温度较高的边缘效应。

注2：细胞状态对ELISPOT检测结果具有重要意义。细胞状态好、活力高、功能保持完整，那么检测获得的结果必然好。因此在进行ELISPOT检测时要尽可能保证细胞处于良好的生长状态。对于新鲜分离的原代细胞，需要尽可能减少分离过程中的机械损伤以及有毒化学物质对细胞的损害。对于冻存后复苏的细胞，通常较难保证细胞的生长状态，因此对细胞冻存过程提出了更严格的要求。

（1）弃去孔内的混合培养液，每孔加入200 μL冰冷的去离子水，在冰浴上孵育10 min。孵育结束后，每孔用200 μL PBST（含0.05%Tween的PBS溶液）溶液洗涤5次，以除去细胞和未结合的细胞因子。最后一次弃去液体后，轻轻在吸水纸上扣干。

（3）孵育结束后，每孔以200 μL PBST溶液洗涤5次，洗涤最后一次时，将PVDF膜板背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，轻轻在吸水纸上扣干。

（5）酶底物显色：每孔加入200 μLPBST溶液洗涤5次，洗涤最后一次时，将PVDF膜板背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，轻轻在吸水纸上扣干。随后每孔加入100 μL BCIP/ NBT（用于ALP）或100 μL AEC（用于HRP）显色液，用铝箔覆盖膜板避光。

（6）待斑点生长到合适大小，以去离子水洗涤2次，终止显色反应。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30 min，让膜自然晾干。

（7）将ELISPOT板置于自动读板仪内，调节好合适的参数后，进行斑点计数并作统计分析[3]。

注：斑点计数时，应注意区分由纤维、膜撕裂、碎片等导致的不规则斑点，一般细胞生成的斑点通常为圆形。

附1：实验所用的刺激物（抗原）类型[4]：

① Freeze and Thaw lysate（细胞冻融产物）

② Class I and Ⅱ Peptides（I类和Ⅱ类肽）

③ Recombinant proteins（重组蛋白）

④ RNA

图注：来自免疫小鼠脾细胞的IFN-γ+斑点形成细胞。C57BL/6小鼠在第0天和第21天单独用OVA（10 μg）或联合明矾（40 μg）+ CpG 1826（10 μg）佐剂进行肌肉注射诱导免疫反应。在第28天收集脾细胞，用IFN-γ ELISpot分析OVA特异性CD4 T细胞。代表性结果如图a-d。a, b：经OVA免疫后分离的小鼠细胞在板中分别用培养基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR（CD4 Epitope）进行刺激。c, d：经OVA+明矾/CpG联合免疫后分离的小鼠细胞在板中分别用培养基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR进行刺激。

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ELISPOT评价T细胞功能注意事项

在前面的实验步骤中，我已经尽可能罗列了各步操作中应当注意的事项，在此根据文献[5]对相关内容再做补充，希望帮助大家拿下这个实验。

（7）每孔细胞数：如果抗原特异性T细胞频率未知，推荐以3-5×10⁵细胞/孔作为起始数目。在1-8×10⁵细胞/孔的范围内，加入的细胞数与形成的斑点数具有良好的线性关系，实际可根据需求进行调整。此外，由于临床样本的珍贵性，PBMC以10⁵细胞/孔设置多个复孔，可以帮助获得较准确的结果。

注：如有必要，可通过滴定来确定ELISPOT实验所使用的细胞密度，以获得特定组织类型来源细胞的最佳斑点分离效果。文献[1]给出了一些常见细胞的推荐使用浓度。在使用纯化的T淋巴细胞或者每孔细胞数少于10⁶时，推荐在活化期间加入额外的饲养层细胞（比如脾细胞）或抗原提呈细胞（APC），前提是确保加入这些细胞有效。特定组织每孔细胞常用浓度为：

⑨人APCs：自体PBMCs 0.5×10⁶细胞/孔

（9）DMSO浓度控制：大多数I类MHC限制性肽是疏水性的，需要用DMSO助溶，超过0.5%浓度的DMSO对淋巴细胞，尤其是活化的淋巴细胞有毒。