荧光成像 失败原因与成功诀窍

要点1：确认使用的物镜是否合适

要进行显微镜观察必须了解观察目的与物镜特性是否相符。尤其在荧光观察中重要的是数值孔径（NA），数值孔径越大，越能获取明亮，正常情况下，数值孔径越大分辨率也越高，可获取精细的图像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）则变浅，被摄物体的可视对焦范围变窄。除此以外，物镜亮度或观察距离也需要考虑，这些特性间的相关关系如下图所示。

另外还有需要盖板玻璃校正^*1及校正环调整^*2的物镜、专用于特殊观察方法的光学设计物镜等各种各具特点的物镜^*3。根据观察方法选择合适的物镜尤为重要。

*1 盖板玻璃校正：
盖板玻璃校正物镜设有盖板玻璃校正值。正常情况下，盖板玻璃使用0.17 mm，塑料培养皿为1.2 mm，不使用盖板玻璃时使用0 mm物镜。

*2 校正环调整：
高倍率物镜中还有外壳部分带有校正环（类似表盘）的部件。根据盖板玻璃的厚度调整校正环，分辨率可变化数倍，使用前请务必确认校正环的状态。

*3 物镜的特点：
按照观察方法，有时需要符合观察方法的特定光学设计物镜。包括相差、微分干涉、偏光、荧光、油镜等。请确认物镜种类。

要点2：从低倍率向高倍率调整物镜

要点3：由近及远查找焦点位置

要点1：使用适合观察的相机

相机也有很多种类，下面介绍广泛用于荧光显微镜的CCD相机的特点。
荧光观察中重要的是S/N比（信号与干扰的比率）足够高，因此在下表中合适的是黑白制冷CCD相机。

*1 可见光：
一般是指波长大约为400至700 nm的光。彩色相机的显示与人眼相同，会切断波长长度700 nm以上的光。因此无法观察。

*2 暗电流和制冷：
CCD相机内部在没有输入光的状态下也会产生叫作“暗电流”的信号，是造成干扰的原因。曝光时间越长受光元件的温度越高，干扰也变大，通过冷却相机可抑制干扰。

要点2：使用调节亮度功能

亮度调节功能有多种，在相机设定中主要的调节方式是以下3个项目。理解这些特点并熟练地区分使用对荧光成像非常重要。

• 曝光时间

• 快门处于开启的时间。为在此期间积蓄信号，曝光时间越长亮度越高，同时暗电流干扰也会累积从而干扰增多。

• 增益

• 对输入CCD元件的电信号进行电性放大。但是，放大输入信号后，干扰也会同时被放大。分辨率不因增益值而变化。

• Binning（像素融合）

• 将临近的像素视为1个假想像素，提高每个单位像素的接收信号量的功能。由于像素被合并图片整体的像素数减少，分辨率将下降，但不会增加干扰。

要点3：荧光滤光片与试剂的匹配

即使荧光信号明亮而发光，如果滤光片透过率过低，仍无法充分观察信号。重要的是尽量使用透过率高的滤光片。
荧光滤光片由激发滤光片与吸收滤光片、二向色镜共3部分组成。确认激发滤光片是否与试剂的激发光谱重叠，吸收滤光片是否与试剂的荧光光谱重叠。假设加入滤光片上标注470/40时，表示可涵盖470nm±20nm的波长范围。数值数据难以理解时，观察试剂与滤光片的光谱数据来判断是否匹配。各种试剂或滤光片的光谱数据可通过各厂商的网站等确认。

要点4：物镜的选择

荧光信号偏弱，或对比度不足时，可通过更换NA值更大的物镜，以便更明亮地观察。 NA值越大，越能够明亮地观察荧光信号。物镜的倍率越高，NA值也趋于变大，S/N比的上升不够理想时，通过使用倍率更高的物镜也可解决问题。

要点5：光源的选择

有些光源没有发出要观察的波长。需要确认使用的光源，了解光源的特点并区分使用。
相比于水银灯或金卤灯是1种光源包含短波长到长波长的大范围波长，激光或LED是1种光源只发出特定范围的波长，因此需要将多个光源组合使用。信号无法顺利发光时，确认试剂与光源波长的光谱数据。

要点1：激发光强度下降

降低激发光强度，荧光就会相应地变暗，因此需要提高相机增益或延长曝光时间。但是，提高增益或延长曝光时间，就会增大暗电流的干扰，S/N比变低。
要在抑制淬灭及损伤的同时拍摄S/N比高的图像，需要尽量使用灵敏度高的相机。

要点2：缩短激发光照射时间

要缩短激发光照射时间，需要降低基本的操作时间，因此尽量缩短对焦时间、信号查找所用的时间、设定曝光时间所用的时间等操作所用的时间。
另外，对于手动控制激发光快门开闭的显微镜类型，可能发生忘记关快门而造成长时间持续照射激发光，导致淬灭。因此拍摄结束后或临时停止观察时，及时关闭快门尤为重要。