介绍三种细胞凋亡试验方法

                                                  介绍三种细胞凋亡试验方法

(一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法:
用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L,在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜.
次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组,设加*培养基不加药物的阴性对照,并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照,每组均设4-6个复孔(平行孔)、37℃、5% CO2继续培养.
培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培养4-6h后,阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应,于37℃存放过夜.
用酶标仪在A570波长下测吸光度值,按下式计算抑制率
抑制率(%)=(1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值) x 100%.

(二)荧光法:
选用上述*浓度作用于肿瘤细胞,培养细胞48h后,收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min.
弃去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI荧光染色60min,用PBS冲洗3次,取10ul滴片,干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光.

(三)DNA琼脂糖凝胶电泳法:
1、DNA提取:
用大方瓶培养肿瘤细胞,每瓶10ml,细胞浓度为3 x 108个/ml,每隔药物浓度、作用时间均设2瓶,共分3个时间段,4个药物浓度.共培养26瓶细胞.
分别于细胞中加入不同浓度的药物,于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h,收货细胞,用PBS洗2-3次.
于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中,加1ml细胞裂解液,再加蛋白酶K,轻轻振摇使悬液混匀,成黏糊状,50℃过夜.
冷却后加入等体积的饱和酚溶液,混合后10000r/min离心10min,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次,直到无蛋白为止.
吸上清加入氯仿/异戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次.
吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液,混匀.
再加入2.5倍体积冷无水乙醇,混合置-20℃处理30min后,10000r/min离心10min,沉淀部分为提供的DNA,弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇.
加入200ulTE缓冲液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存.
2、琼脂糖凝胶电泳:
TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶.在微波炉内煮沸至琼脂糖融解,待冷却至60℃时,加入溴化乙锭,使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶.
待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内,使TBE电泳液盖过凝胶.
取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4:1比例混匀后点样.
60V电泳1h,用紫外透射仪观察梯形条带.