本文要点：前哨淋巴结（SLN）是原发肿瘤引流区域淋巴结中的特殊淋巴结，是原发肿瘤发生淋巴结转移所必经的淋巴结，转移性癌细胞离开肿瘤后有可能集中在SLN。前庭淋巴结切除术（SLNE）是肿瘤外科治疗和术后活检诊断转移的关键步骤，使用的技术包括传统的蓝色染料法、核素探测法以及新兴的荧光探测法。目前侵袭性SLNE的诊断不准确，术后活检耗时，增加了患者本可避免的疼痛和潜在的死亡率。术中准确检测SLN的转移状态并指导转移性SLN的切除，以抑制不必要的SLN清扫引起的并发症，是迫切需要解决的问题。

本文报道了一个基于双示踪剂的NIR-II比率荧光纳米平台，结合了靶向和非靶向部分，可通过记录比率信号来确定SLN通过血管和淋巴向远端的转移状态，并可视化淋巴网络伴随肿瘤生长的详细变化。与临床可用的xian进的NIR造影剂相比，本研究中的双示踪剂的NIR-II比率荧光探针性能显著改进，为快速评估淋巴功能并指导癌症手术期间肿瘤浸润性SLN的去除提供了有力工具。

图1. NIR-II比率荧光探针应用示意图

在作者以往的工作中报道了一对比率纳米颗粒NaYF₄:Nd@NaYF₄（肿瘤靶向性）和NaErF₄@NaYF₄（无靶向性），分别在1060 nm处和1525 nm处显示出强烈的发射，在1500 nm处具有高的信背比（SBR），显著地优于目前临床应用的ICG和IR-800CW，并领xian于作者先前研发的PbS@CdS量子点。在小鼠足部注射后可以精确可视化病变淋巴结（LN）的形态学变化，并准确地绘制LN与周围组织之间的边界。

图2. 比率探针实现清晰、高分辨的NIR-II荧光成像

而要实现对SLN的持续监测，还要求探针必须具有长期的LN保留以及良好的稳定性。作者在正常小鼠中对4种荧光分子分别进行累积行为和光稳定性测试，发现量子点和比例探针都表现出长期的LN保留，成像窗口可达约168小时；比例探针不仅在连续激发下表现出显著的稳定性，而且消除了区域荧光信号减弱引起的背景干扰。可见该比率探针可以提供足够的时间窗口来收集有用的信息并完成手术程序。

图3. 近红外荧光团体内成像质量和光稳定性比较

肿瘤附近的淋巴结可分为正常、炎症和转移期3种。目前依赖于SLN大小区分的成像探针灵敏度较低，因为转移性和炎症性SLN形态变化差异较小。而利用比率探针，通过在小鼠足垫注射4T1细胞建立后肢肿瘤模型，记录1000-1100nm和1500 nm窗口内的荧光信号并计算荧光比，可以分辨SLN中是否存在转移性肿瘤。作者观察到，荷瘤小鼠中来自NaYF₄:Nd@NaYF₄的信号明显强于NaErF₄@NaYF₄的信号，而在正常小鼠中则没有这种差异，与切除LN离体成像所得到的结果一致。

探针注射后30分钟的信号采集便足以诊断肿瘤转移性LN，而比率探针的长保留时间为检测和手术提供了足够长的成像窗口。调整可变焦透镜还可以实现区域放大图像，不仅揭示了LN的形态大小与转移状态之间的关系，同时还有助于更有效地切除病变淋巴结。这些结果进一步验证了比率探针作为快速转移鉴别造影剂具有足够的可靠性和独te的优势。

图4. 肿瘤引流LN的可视化检测

延长对SLN的监测时间，可以观察到SLN的转移状态，同时使炎症性SLN和转移期SLN的分辨更加清晰。小鼠肿瘤模型建立后14d内，仅能观察到SLN大小增加，比率信号却与阴性组相差无几；28d以后可见SLN大小进一步增加的同时比率信号显著增强。由此可见：肿瘤在早期仅使SLN发生炎症，并不向其转移；而随着肿瘤发展，SLN将逐渐被迁移的肿瘤细胞浸润。这一发现被炎症因子（IL-6）免疫组化和H&E染色结果进一步证实。

图5. 基于比例荧光图像的SLN转移状态鉴定

作者通过在肿瘤中直接注射比率探针，尝试直接评估后肢周围与肿瘤生长平行的淋巴管网络的变化。在NIR-Ⅱ荧光下可见原发肿瘤周围的淋巴管数量逐渐增加，淋巴管网络随着肿瘤的生长而不断变化。

一般来说，腹股沟淋巴结与足部淋巴结通过淋巴管相连，即使不能呈现出比率型信号，也可被从肿瘤注射的探针照亮。但作者意外发现，仅在肿瘤生长的第28天和第40天，比例探针才能照亮腹股沟淋巴结。这意味着早期肿瘤可能使小鼠淋巴管受损，但随着肿瘤进展，淋巴管又重定向到腹股沟淋巴结，从而导致腹股沟淋巴结也被肿瘤细胞浸润。这一意想不到的发现进一步证明比率探针作为检测平台的足够可靠性和灵敏度，具有现有探针无法实现的高对比淋巴管网络成像能力和精确识别SLN转移状态的功能。

图6. 比率探针鉴别肿瘤细胞引流LNs的可靠性

前哨淋巴结转移状态的诊断对于规划癌症治疗的个性化治疗程序至关重要。将成像扩展到更长的窗口可以消除自发荧光/散射干扰，并且所选NIR-II荧光团的长时间保留和优异的光稳定性优于NIR-I荧光团，用于活体内LNs成像。与仅提供LNs成像能力的量子点相比，多功能比例荧光探针可以同时作为生物传感器，实现对生理过程变化的高分辨率监测。比率荧光探针通过有效肿瘤细胞靶向能力，有助于通过SLNs的成像大小和比率值来区分肿瘤细胞侵袭和发炎的SLN。这些结果表明，基于比率荧光成像的策略可以灵敏、无chuang地识别/确定SLNs的转移状态，并排除无肿瘤SLNs，从而减少不必要的手术侵袭。

参考文献

Li M, Sun B, Zheng X, Ma S, Zhu S, Zhang S, Wang X. NIR-II Ratiometric Fluorescence Probes Enable Precise Determination of the Metastatic Status of Sentinel Lymph Nodes. ACS Sens. 2024 Feb 21.

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