1、胆固醇对蛋白冠形成的影响

2、胆固醇调节蛋白冠的蛋白质组指纹图谱

为了获得有关在胎牛血清中的SNP上形成的Nor-PC和Cho-PC的蛋白质指纹图谱的信息，进行了蛋白质组分析（扩展数据图3b）。结果表明，血清中的高水平胆固醇可以丰富载脂蛋白并减少NP上PC中的补体蛋白。

PC的形成遵循“Vroman效应”，即早期吸附的高丰度蛋白质将被具有更高亲和力的蛋白质竞争性取代。接下来通过微尺度热泳(MST)测量了这两种蛋白与有或没有胆固醇的SNP的结合亲和力（图2e）。表明，胆固醇可以通过差异调节结合蛋白的亲和力来重塑PC中的蛋白质丰度。然后，进行了分子动力学模拟，以探索在存在和不存在胆固醇的情况下APOE和SNP之间的相互作用。结果表明，胆固醇-蛋白质和胆固醇-NP相互作用有助于重塑Cho-PC组成的结论。

3、胆固醇-蛋白冠增加巨噬细胞对纳米颗粒的免疫反应

由于PC已被广泛认为是NP的生物学特性，于是探讨了Cho-PC对NP体外和体内行为的影响。由于游离胆固醇和胆固醇预处理的NP都不能增加免疫反应（图3e，f），因此对NP的免疫反应增加主要受到PC中胆固醇介导的变化的影响。然后，进行蛋白质组分析，以鉴定与SNPs-Cho-PC和SNPs-Nor-PC孵育后巨噬细胞中差异表达的蛋白质。与对照组相比，SNPs-Nor-PC治疗组中鉴定出788个下调蛋白和785个上调蛋白（扩展数据图7c）。尽管Nor-PC和Cho-PC都激活了巨噬细胞的免疫反应，但Cho-PC引发了更强的反应。通过炎症相关通路的基因集变异分析(GSVA)评分，发现了一致的变化（图3i）。这些结果表明，Cho-PC可能比Nor-PC更大程度地增加免疫系统响应NP的激活风险。

4、Cho-PC增强肝细胞对NP的细胞摄取

由于细胞摄取对于纳米药物的药代动力学和靶向效率至关重要，并且药物通常由肝细胞代谢，进一步研究Cho-PC是否可能影响肝细胞中NP的细胞内化。使用HepG2细胞作为人肝细胞的体外模型，首先评估了AuNP（扩展数据图8a）和SNP（扩展数据图8b）的细胞毒性，发现HepG2细胞内有更多的AuNPs-Cho-PC积累（图4f，g）。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析发现，Cho-PC组中检测到的Au多于Nor-PC组（图4h）。由于向培养基中添加胆固醇会抑制NP内化（扩展数据图8d-g），因此细胞对NP的摄取增强可能应归因于胆固醇诱导的Cho-PC的特定蛋白质成分，而不是胆固醇本身。

为了进一步研究Cho-PC诱导的NPs增强细胞摄取所需的关键因素，检测在不同类型的内吞作用抑制剂存在下NPs的内化（图4i-k和扩展数据图8h-m）。结果表明，胆固醇和肌动蛋白驱动的机制有助于增强对高胆固醇血清中形成的冠-纳米颗粒复合物的摄取。由于摄取所需的细胞表面受体在PC介导的细胞摄取NPs中的既定作用，测试了低密度脂蛋白受体(LDLR)和B型清道夫受体1型(SR-B1)是否参与。在竞争测定中，细胞预先与LDL和HDL预孵育以阻断LDLR和SR-B1，并使用牛血清白蛋白(BSA)孵育作为对照。尽管预孵育在一定程度上抑制了SNPs-Nor-PC和SNPs-Cho-PC的摄取，但只有LDL和HDL对SNPs-Cho-PC的摄取具有比对SNPs-Nor-PC更明显的抑制作用（图4l）。因此，LDLR和SR-B1可能参与脂蛋白介导的内化增强。

5、高胆固醇血症小鼠体内纳米颗粒的生物分布

Cho-PC是否可以改变NP的体内生物分布，通过高胆固醇饮食喂养小鼠15周建立高胆固醇血症小鼠模型（图5a）。详细分析发现，与FBS和人血清中的结果相比，PC的蛋白质组成发生了类似的变化（图5c、d和扩展数据图9）。因此，血清胆固醇差异水平对PC制剂的调节也可以在小鼠高胆固醇血症模型中重现，与人血清结果一致。接下来，比较了从正常小鼠和高胆固醇血症小鼠收集的血液和组织中AuNP的体内生物分布（扩展数据图10a、b）。1小时后，在高胆固醇血症小鼠中观察到肝脏中锌和铜水平增加。当24小时时，肝脏中的差异消失，但睾丸、肠、肾和脾中出现差异，这表明某些金属元素的分布可能受到健康状态依赖性静脉注射纳米药物方式的影响。研究结果表明，当对健康和高胆固醇血症个体进行静脉注射时，基于纳米粒子的纳米药物可能会出现不同的体内命运，例如生物相容性和生物分布，这为精密纳米医学提供了重要的见解（图6）。用荧光标记的衍生物测量了SNP的体内分布，结果表明，高胆固醇血症会影响纳米粒子的体内生物分布。