中华人民共和国国家标准

GB 5009.26-2023

食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定

前言

  本标准代替GB5009.26-2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》。

  本标准与GB 5009.26-2016相比，主要变化如下：

  ——增加了第一法水蒸气蒸馏-气相色谱质谱/质谱法；

  ——增加了第二法QuEChERS气相色谱-质谱/质谱法；

  ——增加了第三法水蒸气蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法；

  ——删除了气相色谱-质谱法；

  ——修改了原第二法气相色谱-热能分析仪法为第四法；

  ——修改了前处理蒸馏法条件、气相色谱热能分析仪法的检出限和定量限。

1范围

  本标准规定了食品中N-二甲基亚硝胺（NDMA）的测定方法。

  本标准适用于肉及肉制品、水产动物及其制品中N-二甲基亚硝胺的测定。

第一法 水蒸气蒸馏-气相色谱质谱/质谱法

2原理

  本法以N-二甲基亚硝胺-D6为内标，试样中加入内标，经水蒸气蒸馏，样品中的N-二甲基亚硝胺通过二氯甲烷吸收，液液萃取分离，采用气相色谱质谱/质谱仪（GC-MS/MS）测定，内标法定量。

3试剂与材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1二氯甲烷（CH2Cl2 ）：色谱纯。

3.1.2浓硫酸（H2SO4）：18.4 mol/L。

3.1.3异辛烷（C8H18）：色谱纯。

3.1.4无水硫酸钠（Na2SO4）。

3.1.5 氯化钠（NaCl）：优级纯。

3.2试剂配制

  硫酸溶液（1+3）：量取30 mL浓硫酸，缓缓倒入90 mL冷水中，一边搅拌使得充分散热，冷却后小心混匀。

3.3标准品

3.3.1 N-二甲基亚硝胺标准溶液（C2H6N2O，CAS号：62-75-9）：质量浓度为1 000 μg/mL的N-二甲基亚硝胺甲醇溶液，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.3.2 N-二甲基亚硝胺-D6内标标准溶液（NDMA-D6，C2D6N2O，CAS号：17829-05-9）：质量浓度为1 000 μg/mL，溶剂为甲醇。

3.4标准溶液配制

3.4.1 N-二甲基亚硝胺标准储备液（100μg/mL）：准确吸取1.0mL N-二甲基亚硝胺标准溶液（1 000 μg/mL），置于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，-18℃避光保存，保存期6个月。

3.4.2 N-二甲基亚硝胺标准中间液（1 μg/mL）：准确吸取1.0 mL N-二甲基亚硝胺标准储备溶液（100 μg/mL），置于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，-18℃避光保存，保存期3个月。

3.4.3 N-二甲基亚硝胺-D6内标储备液（100 μg/mL）：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D6标准溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，-18℃避光保存，保存期6个月。

3.4.4 N-二甲基亚硝胺-D6内标中间液（1μg/mL）：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D6内标储备液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，-18℃避光保存，保存期3个月。

3.4.5 N-二甲基亚硝胺标准及内标混合系列工作液：分别准确吸取N-二甲基亚硝胺标准中间液（1μg/mL）0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，各加内标中间液（1 μg/ mL） 0.4 mL，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。N-二甲基亚硝胺标准系列工作溶液质量浓度为10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L，其中内标的质量浓度均为40μg/L。临用现配。

4仪器和设备

4.1气相色谱-质谱/质谱联用仪（GC-MS/MS）。

4.2旋转蒸发仪。

4.3全玻璃水蒸气蒸馏装置或全自动水蒸气蒸馏装置（见附录A中图A.1）。

4.4氮吹仪。

4.5电子天平：感量为0.001 g。

4.6制冰机。

4.7冷却水制备机。

4.8水浴锅。

4.9 10 mL带刻度试管。

4.10 100μL~1 000μL移液器或分度吸量管。

5分析步骤

5.1样品前处理

5.1.1试样制备

  代表性样品取可食部分捣碎后，制备成均匀试样，装入洁净的容器，密封并做好标识。试样于-18℃冷冻保存，备用。

5.1.2 提取

  准确称取20 g（精确到0.01 g）试样，加入N-二甲基亚硝胺内标标准中间液（1 μg/mL）40 μL，加入100 mL水和50 g氯化钠于蒸馏瓶（管）中，充分混匀。载样前后均需进行气密性检查。在250 mL三角烧瓶中加入50 mL二氯甲烷、0.5 mL异辛烷，冷凝管（冷却水温度控制在10 ℃~15℃）出口伸入二氯甲烷液面下，并将三角烧瓶置于冰浴中，开启蒸馏装置加热蒸馏（参考条件：自动蒸馏装置蒸汽功率设置为50%），收集200 mL~250 mL冷凝液（包含50 mL二氯甲烷提取液）后关闭加热装置，停止蒸馏。

  注：蒸汽功率设置目的为控制蒸汽量，蒸汽加热样品时不致使样品瀑沸至蒸馏管腔体外。

5.1.3净化

  在盛有冷凝液的三角瓶中加入15 g氯化钠和2 mL硫酸溶液，搅拌使氯化钠完全溶解。然后将溶液转移至500 mL分液漏斗中，振荡5 min，必要时放气，静置分层后，将二氯甲烷层转移至另一圆底烧瓶中，再用120 mL二氯甲烷分3次萃取，每次40 mL萃取，合并4次二氯甲烷萃取液，总体积约为170 mL。

5.1.4浓缩

  将二氯甲烷萃取液用10 g无水硫酸钠脱水后，于5℃~18℃水浴温度条件下旋转蒸发浓缩至5 mL~10 mL，转入试管中，控制氮吹温度在18℃~25℃，氮吹（参考条件：氮吹流速1 L/min）至近干（0.3 mL~0.8 mL），用二氯甲烷溶解残渣，准确定容至1.0 mL，上机检测。

  注：控制氮吹流速，不致使液体飞溅管壁。

5.2仪器参考条件

5.2.1气相色谱条件

a）色谱柱：强极性石英毛细管WAX柱，固定相为聚乙二醇[30 m×0.25 mm（内径）×0.25μm（膜厚）]，或相当者。

b）进样口温度：220℃。

c）载气：氦气，纯度≥99.999% ；流速1 mL/min。

d）进样方式：不分流进样。

e）进样量：1μL。

f）升温程序：初始温度40℃，以10℃/min升至80℃，以1 C/min升至90℃，再以30℃/min升至240℃，保持2 min。

5.2.2质谱/质谱条件

a）离子源温度：250℃。

b）色谱与质谱接口温度：250℃。

c）电离方式：电子轰击源（EI源）。

d）电离能量：70 eV。

e）溶剂延迟：6 min。

f）四级杆温度：150℃。

g）监测模式：多反应监测（MRM）模式，离子对参数见表1。

5.3 标准曲线的制作

  将N-二甲基亚硝胺标准及内标混合系列工作溶液按浓度由低到高的顺序注入气相色谱-质谱/质谱仪进样分析，以N-二甲基亚硝胺的质量浓度为横坐标，以N-二甲基亚硝胺及其对应氘代同位素内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。N-二甲基亚硝胺标准溶液的色谱图参见附录B中图B.1和图B.2。

5.4试样溶液的测定

5.4.1定性测定

  按照5.2所述条件测定试样和标准系列工作溶液，试样的质量色谱峰保留时间应与标准物质一致，允许偏差小于±0.5% ，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现且信噪比≥3，而且定性离子对的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准使用溶液的相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

5.4.2定量测定

  将试样溶液注入气相色谱质谱/质谱仪中，得到N-二甲基亚硝胺的峰面积与对应同位素内标的峰面积的比值，根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。样液中N-二甲基亚硝胺的峰面积比值应在标准曲线的线性范围内；如果含量超过标准曲线范围，需调整称样量或定容体积重新检测，若调整定容体积，应调整内标的添加量，使最终定容后内标与标准曲线内标的质量浓度一致。

5.5空白试验

  用水代替试样，按5.1及5.2所述操作步骤进行，必要时，进行环境空白的测定，空白测定值需低于该方法的定量限的50%。

6分析结果的表述

试样中N-二甲基亚硝胺含量按式（1）计算。

式中：

X——试样中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

ρ——试样中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；.

ρ0——空白试验溶液中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V——试液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

1 000——换算系数；

m——试样的质量，单位为克（g）。

计算结果保留小数点后2位数字。

7精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

8其他

8.1方法检测限

  称样量为20 g，定容体积为1.0 mL时，本方法检出限为0.30μg/kg，定量限为1.00 μg/kg。

8.2 安全警示

  本试验所涉及的对人体可能造成危害的试剂包括有机溶剂（如乙腈、正己烷）等。试验人员有可能因接触这些物质而带来风险，因而，涉及这些物质的试验操作中应在通风橱内进行，并佩戴专业的防护工具（如手套、口罩等）。

  亚硝胺类化合物是强致癌物，试验结束后，随意丟弃这些物质可能会对人员及环境造成损害，同时，在处理不当时，试验用的N-二甲基亚硝胺标准品及过期标准物质也可能带来风险，因而，在试验过程中不得随意丢弃这些物质，应分别回收在密闭容器并保存在远离火源、通风良好的环境中。