中华人民共和国国家标准

GB 5009.296-2023

食品安全国家标准 食品中维生素D的测定

第三法 液相色谱-串联质谱法

16 原理

  试样加入维生素D2和维生素D3的同位素内标后，经氢氧化钾乙醇溶液皂化（含淀粉试样先用淀粉酶酶解） ，正己烷提取，固相萃取柱净化、浓缩后，通过C18柱将维生素D2、维生素D3与其他杂质分离，串联质谱检测，内标法定量。

17试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

17.1 试剂

17.1.1无水乙 醇（C2H6O）：色谱纯。

17.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。

17.1.3 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。

17.1.4 氢氧化钾（KOH）。

17.1.5正己烷（C4H14）。

17.1.6 a-淀粉酶（CAS号：9000-90-2，中温淀粉酶，来源于芽孢杆菌属）：酶活力>1.5 U/mg。

17.1.7甲醇（CH4O）：色谱纯。

17.1.8无水硫酸钠（Na2SO4）。

17.1.9乙酸乙酯（C4H8O2）。

17.1.10甲酸（CH2O2）：色谱纯。

17.1.11甲酸铵（CH5O2N）：色谱纯。

17.2试剂配制

17.2.1 氢氧化钾溶液（50%，质量分数）：同3.2.1。

17.2.2 BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL）：同3.2.2。

17.2.3乙醇-水溶液（2+3）：将乙醇和水按2 ： 3的体积比混合均匀。

17.2.4乙酸乙酯-正己烷溶液（1+ 19），将乙酸乙酯与正己烷按1 ： 19的体积比混合均匀。

17.2.5乙酸乙酯-正己烷溶液（3+ 17），将乙酸乙酯与正己烷按3： 17的体积比混合均匀。

17.2.6流动相A：0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液：称取0.315g甲酸铵于1000 mL烧杯中，加入1 000 mL水溶解，再加入0.5 mL甲酸，混匀，过滤膜，超声脱气。

17.2.7 流动相B：0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液：称取0.315 g甲酸铵于1 000 mL烧杯中，加入1 000 mL甲醇溶解，再加入0.5 mL甲酸，混匀，过滤膜，超声脱气。

17.3 标准品

17.3.1 维生素D2标准品：同3.3.1。

17.3.2维生素 D3标准品：同3.3.2。

17.3.3维生素 D2-d3内标溶液：100 mg/L。

17.3.4维生素 D3-d3内标溶液：100 mg/L。

17.4标准溶液配制

17.4.1 维生素D2标准储备溶液（1 000 mg/L）：同3.4.1。

17.4.2 维生素D3标准储备溶液（1 000 mg/L）：同3.4.2。

17.4.3 维生素D2标准中间液（100 mg/L）：吸取10.00 mL维生素D2标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。在-18℃下避光保存，保存期3个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.4维生素 D3标准中间液（100 mg/L） ：吸取10.00 mL维生素D3标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。在-18℃下避光保存，保存期3个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.5 维生素D2和维生素D3混合标准使用液（其中维生素D2质量浓度为2.00 mg/L、维生素D3质量浓度为1.00 mg/L）：分别吸取2.00 mL维生素D2标准中间液、1.00 mL维生素D3标准中间液，用流动相稀释并定容至100 mL。在-18℃下避光保存，保存期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。

17.4.6 维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标使用液（维生素D2-d3质量浓度为2.00 mg/L，维生素D3-d3质量浓度为1.00 mg/L）：分别吸取200 μL维生素D2-d3内标溶液、100μL维生素D2-d3内标溶液于同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合内标使用液。在-20℃下避光保存，保存期1个月。

17.4.7 维生素D标准系列工作溶液：分别吸取维生素D混合标准使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D2-d3 和维生素D3-d3混合内标使用液1.00 mL，用甲醇定容至刻度。此标准系列工作溶液浓度中维生素D2质量浓度分别为20.0μg/L、40.0μg/L、100.0μg/L、200μg/L、300μg/L、400μg/L，维生素D2-d3的质量浓度为200μg/L；维生素D3质量浓度分别为10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L，维生素D-d3的质量浓度为100μg/L。临用前配制。

17.5材料

17.5.1 固相萃取柱：硅胶基质，6 mL，500 mg，或相当者。

17.5.2微孔滤膜：有机系，孔径0.22 μm。

18仪器和设备

18.1液相色谱申联质谱仪，带电喷雾离子源。

18.2 天平，感量为0.1 mg、0.001 g、0.01 g。

18.3 紫外分光光度计，带1 cm石英比色皿。

18.4磁力搅拌器，带加热、控温功能。

18.5 恒温振荡器。

18.6 多功能振荡器，使用适用于50 mL离心管的适配器，转速≥1 500 r/min。

18.7 离心机，使用适用于50 mL离心管的适配器，转速≥8 000 r/min。

18.8 旋转蒸发仪。

18.9 氮吹浓缩仪。

18.10超声波清洗器。

19 分析步骤

19.1 样品前处理

  处理过程应避免紫外光照射。

19.1.1 试样制备

  将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品袋中，避光冷藏，尽快测定。

19.1.1.1婴幼儿配方食品 特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料

  固体试样：按5.1.1.1制备试样溶液，称取制备后的溶液10 g（m3，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。并按式（1）计算粉末样品质量（m）。

  液体试样：称取摇匀后的试样10 g（m，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。

19.1.1.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  称取均质后的试样5 g~10 g（m，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中，加入约20 mL温水（40℃~45℃），置于磁力搅拌器中搅拌10 min，混匀。婴幼儿谷类辅助食品等难均质的试样，可参考5.1.1.1先制成浆液，再称取制备后的浆液20 g~50 g（m3，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。

19.1.1.3油脂及其制品、肉及肉制品、水产及其制品、蛋及蛋制品

  称取均质后的试样0.5 g~2 g（m，精确至0.001 g）至50 mL带螺旋盖的离心管，加入8 mL~9.5 mL的温水（40℃~45℃），混匀。对于难均质的试样，可参考5.1.1.1先制成浆液，再称取制备后的溶液10 g（m3，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。

19.1.1.4水果、蔬菜、豆类、食用菌、坚果和籽类

  称取均质后的试样10 g（m，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。千制品称取均质后的试样0.5g~2 g（精确至0.001 g）至50 mL带螺旋盖的离心管，加入8 mL~9.5 mL的温水（40℃~45℃），置于涡旋振荡器中振荡10 min，混匀。

19.1.1.5含蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  称取均质后的试样2 g~20 g（m ，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶。

19.1.2试样皂化

19.1.2.1婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料等试样

  按19.1.1.1、19.1.1.3、19.1.1.4描述的样品前处理方法称取适量试样于50 mL离心管中，加入100 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标使用液，再加入0.4 g抗坏血酸，涡旋1 min，加入10 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），涡旋30 s，再加入5 mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数），涡旋混匀后于恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。

19.1.2.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  在19.1.1.2描述的150 mL平底烧瓶中，加入400 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3 混合内标使用液以及1.0g a-淀粉酶，放入1颗磁力搅拌子，加上瓶塞，放入60℃磁力搅拌器中酶解30 min，立即冷却至室温，向酶解液中加入1.0 g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），混匀。再加入10 mL~20mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数），边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃ ，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液（2+ 3）将皂化液转移至100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，准确移取25 mL皂化液于50 mL的离心管中。

19.1.2.3 含蜂蜡等胶质样品和其他食品

  在19.1.1.5描述的150 mL平底烧瓶中，加入400 μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液，加入1.0g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），放入1颗磁力搅拌子，将平底烧瓶置于磁力搅拌器中搅拌10 min，混匀，再加入约20 mL温水（40℃~45℃），混匀。再加入10 mL~ 20 mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数），边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液（2+3）将皂化液转移至100 mL容量瓶中，摇匀，准确移取25 mL皂化液于50 mL离心管中。

19.1.3试样提取

  向上述离心管中加入20 mL正己烷，振荡提取3 min，8 000 r/min离心3 min。转移上层清液到另一个50mL离心管，加入25mL水，振荡30s，在8000r/min条件下离心3min，待净化。

19.1.4试样净化

  将固相萃取柱依次用8mL乙酸乙酯、8mL正己烷活化平衡，将上层提取液转移至固相萃取柱净化。用6 mL乙酸乙酯正己烷混合溶液（1+19）淋洗，6 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液（3+17）洗脱。洗脱液置于40℃下氮吹浓缩装置吹至近干，加入1.0 mL甲醇，超声30 s，涡旋30 s，过0.22 μm微孔滤膜供仪器测定。

  注：为防止将水带入固相萃取柱，上层提取液可留少许正己烷有机相。

19.2 仪器参考条件

19.2.1色谱参考条件

色谱参考条件如下：

a）色谱柱：多环芳烃（PAH）C18柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径1.8 μm，或相当者；

b）柱温：35℃；

c）流动相：A相，0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵水溶液；B相，0.05%甲酸-5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；流动相洗脱梯度见表1；

d）流速：0.4 mL/min；

e）进样量：10 μL。

质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a）电离方式：ESI+ ；

b）毛细管电压：3 kV； .

c）干燥气温度：375℃；

d）多反应监测（MRM）模式。

监测离子对和碰撞能量见表2，质谱图见图B.4。

19.3 标准曲线的制作

  将标准系列工作溶液分别注入液相色谱串联质谱仪中，，以标准系列工作溶液中维生素D2或维生素D3的浓度与相应同位素内标的浓度比值为横坐标，以维生素D2或维生素D3与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，分别绘制维生素D2、维生素D3标准曲线。维生素D2和维生素D3标准溶液的色谱图参见图B.3。

19.4试样溶液的测定

  将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中进行测定。

19.4.1定性分析

  在同样测试条件下，试样溶液中维生素D2、维生素D3的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间相比，偏差在±2.5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。

19.4.2定量测定

  将试样溶液依次进样，得到试样溶液中维生素D2或维生素D3与其相应内标物的峰面积比值，根据标准曲线得到试样溶液中维生素D2或维生素D3的量。试样溶液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围，可以适当减少取样量重新测定。

19.5空白试验

  不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。

19.6分析结果的表述

  试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，按式（6）和式（7）计算。

式中：

X——试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；

N——试样溶液中维生素D2 （或维生素D3 ）与其同位素内标的峰面积比值对应的质量，单位为

纳克（ng） ，按式（7）计算；

100——由每克换算为每百克的换算系数；

m——试样的取样量，单位为克（g）；

1 000——由ng换算为μg的换算系数。

式中：

K——从标准曲线查得的质量比；

N_is——试样中加入的内标的质量，单位为纳克（ng）。

  计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

  如试样中同时含有维生素D2和维生素D3，维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。

19.7 精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

19.8 其他

  当固体试样取样量为2.00 g、定容1.00 mL时，维生素D2的检出限为0.3μg/100 g，定量限为1.00μg/100 g；维生素D3的检出限为0.15μg/100 g，定量限为0.50μg/100 g。

  当液体试样取样量为10.00 g、定容1.00 mL时，维生素D2的检出限为0.06μg/100 g，定量限为0.20μg/100 g；维生素D3的检出限为0.03μg/100 g，定量限为0.10μg/100 g。