一、原理

蛋白质免疫印迹法即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二、流程图：

(一)蛋白上清液提取：

a、准备工作：分装需要体积的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分别加蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：PMSF 体积比为100:1），磷酸化蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制剂，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）体积比为 100:0.2；

b、剪取适量组织（尽量保证每一粒样品都剪去的一样多）和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01g组织加上50-100ul的蛋白裂解液），直至看不见组织块；

c、转移匀浆液于 1.5ml 离心管中，置于冰上蛋白裂解10min；

d、提前开离心机预冷，4℃，12000rpm 离心 15min ；

e、将离心后的上清分装转移倒 1.5ml 新的离心管中，部分用于实验多余的存于-20℃；

若实验对象为细胞：悬浮细胞、贴壁细胞

悬浮细胞：

①收细胞：细胞悬液收集到离心管中，5000rpm，去上清，加1mlPBS，5000rpm，5min，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min；

②打蛋白：超声仪，探头使用前用纯水清洗，探头伸入液面以下，避免太多；设置程序：（打3s，停3s，共计92次）；破碎细胞后，4℃，12000rpm，10min离心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。

注意：

①贴壁细胞：先用PBS缓冲液清洗两遍，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用细胞刮板将细胞+蛋白裂解液移至离心管中。

②一管细胞打20次左右，打蛋白的过程中会发热，可暂停置于冰上数秒。

BCA测蛋白浓度：（通常利用BCA试剂盒测定），基本流程如下：

96孔板：（一般最外围的孔不利用或加等体积的PBS溶液防止污染和蒸发）

（1）蛋白标准品BSA做标曲，取7个EP管，编号①-⑦

（2）浓度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（单位：mg/ml）

（3）②-⑦+50ulPBS，①-②+50ulBSA

（4）②混匀，取50ul加③，依次加到⑥

（5）配样品浓度：45ulPBS+5ul样品浓度，配完短暂离心混匀（计算浓度时×10）

（6）配制工作液，配完避光，现配现用（A液：B液=50:1，一个孔要200ul工作液）：一个样要2个重复孔，计算体系：7个标准品+1个待测液溶液×2，共计16孔；防止加样误差，配置20个体系，一个200ul（20×200=4000ul/4ml）

（7）加样到96孔板：一个孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液；标准品从⑦-①加，两个平行孔一起加。

（8）37℃孵育30min（孔板底部勿触碰，保持干净）

1. 测562nm处OD值，制作标准曲线（excel）
   
   

(三)电泳

1、配制上样体系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上样量：20-50ug

5、盖上电源盖，正负极相互对应，接通电源，恒压浓缩胶80V，30min或maker分离后可更改电压为120v，跑分离胶。待 loading buffer中的溴酚蓝跑至脚底部 1cm 处停止电泳。整个时间大概为 1.5h-2h。

2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。

注意：一抗，二抗孵育洗膜时间可以灵活调整，一般3-5次，5min一次

Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀释液

致局部短路，也散发热量。

2、条带畸形最主要可能是胶没有混匀，转膜过程中胶与膜中间有气泡。条

带拖尾，应该是蛋白杂质较多。

3、 配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看

似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒或疙瘩，可能会导致在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。

4、背景深

（3）缩短二抗孵育时间；

5 、没有条带

若丽春红染色没有条带，则可以放弃此膜，转膜前面的步骤哪里出错，有可能蛋白浓度低或蛋白未提出。

6 、曝光过后，若是β-actin 这样的内参很明显的降解成了两条带，则说明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巯基乙醇这类的还原剂失效。

9 、APS（过硫酸铵）会失效，10%APS一般保质期才一个月左右，APS失效胶会不凝，要4℃避光保存。

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