中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 5520-2023

动物源食品中苯乙醇胺A的测定 液相色谱-质谱/质谱法

Determination of phenylethanol amine A residues in foodstuffs for animal origin-Liquid chromatography tandem mass spectrometry method

前 言

  本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

  请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。

  本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

  本文件起草单位：郑州海关技术中心、厦门海关技术中心、武汉海关技术中心。

  本文件主要起草人：张守杰、祝伟霞、王向军、孙转莲、杨冀州、徐敦明、张淑霞、王素方、赵晓亚、史方、刘朝晖、乔晴、刘军红。

1 范围

  本文件规定了动物源食品中苯乙醇胺A 残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法。

  本文件适用于畜肉及内脏、猪肠衣、羊肠衣、鸡肉、牛奶等动物源食品中苯乙醇胺A 的测定。

2 规范性引用文件

  下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

  GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义

  本文件没有需要界定的术语和定义。

4 方法提要

  试样中苯乙醇胺A 残留用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶解后乙酸铵溶液提取，正己烷脱脂，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化后，液相色谱-质谱/质谱仪测定，同位素内标法定量。

5 试剂和材料

  除另有规定外，所有实验用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682中规定的一级水。

5.1 甲醇：色谱纯。

5.2 乙腈：色谱纯。

5.3 乙酸乙酯：色谱纯。

5.4 正己烷：色谱纯。

5.5 乙酸铵：色谱纯。

5.6 甲酸：色谱纯。

5.7 冰乙酸。

5.8 氨水：25%~28%（ω/%）。

5.9 盐酸：36%~38%（ω/%）。

5.10 β-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶：含β-葡萄糖醛酸甙酶111 000 U/mL，芳香硫酸酯

酶1 079 U/mL。

5.11 0.1 mol/L盐酸溶液：吸取0.85 mL盐酸，用水定容至100 mL，混匀。

5.12 0.1%甲酸溶液：准确量取1.0 mL甲酸，用水定容至1 000 mL，混匀。

5.13 乙腈-0.1%甲酸溶液（1：9，体积比）：移取50 mL水，加入0.1 mL甲酸和10 mL乙腈，用水定容至100 mL混匀。

5.14 0.02 mol/L乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵加入600 mL~700 mL水溶解，用冰乙酸调节pH值为5.2±0.2，用水定容至1 000 mL。

5.15 洗脱溶液，氨水-甲醇-乙酸乙酯（5∶45∶50，体积比）：准确量取5 mL氨水、45 mL甲醇、50 mL乙酸乙酯混合均匀。

5.16 标准品：苯乙醇胺A（C19H24N2O4，CAS号：1346746-81-3），纯度≥99%。

5.17 内标：苯乙醇胺A-D3（C19H21D3N2O4），纯度≥99%。

5.18 标准储备溶液：准确称取苯乙醇胺A 标准品（5.16）、苯乙醇胺A-D3标准品（5.17）各10 mg（精确到0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中保存，有效期9个月。

5.19 标准中间工作溶液：分别吸取1 mL标准储备溶液（5.18）用甲醇稀释至100 mL，该标准中间工作溶液1.0 μg/mL的标准工作液，于-18 ℃冰箱中保存，有效期2个月。

5.20 标准工作溶液：分别吸取适量标准中间工作液（5.19）用0.1%甲酸溶液-乙腈（5.13）稀释，得到0.1 μg/mL的标准工作液，该溶液临用前配置。

5.21 系列标准工作溶液：分别取不同体积的标准工作溶液（5.18）和50 μL 的内标标准工作溶液（5.18）配置标准系列浓度为0.3 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL（内标浓度为5.0 ng/mL），该溶液临用前配置。

5.22 固相萃取（SPE）柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，填料为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg/3 mL或相当者，使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL0.1 mol/L盐酸活化，保持柱体湿润。

5.23 有机相滤膜：0.22 μm。

5.24 定性滤纸。

6 主要仪器和设备

6.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。

6.2 天平：感量为0.1 mg和0.01 g。

6.3 恒温振荡水浴锅。

6.4 氮吹仪。

6.5 涡旋振荡混合器。

6.6 离心机：转速≥10 000 r/min。

6.7 固相萃取仪。

6.8 具塞离心管：10 mL。

6.9 均质器：转速大于10 000 r/min。

6.10 组织绞碎机。

7 样品制备与保存

7.1 动物肌肉、内脏

  取出代表性样品约500 g，组织绞碎机绞碎，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18 ℃以下冷冻存放。

7.2 肠衣

  盐渍肠衣样品先用剪刀剪成小于5 mm 宽的段，用清水洗去盐分，再用蒸馏水冲洗，在丝网器皿上摊开沥去水分5 min，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器内密封并做好标识，于-18 ℃以下冷冻保存。

7.3 牛奶

  取500 mL牛奶于洁净容器中，混合均匀，于-18 ℃以下冷冻存放。

  在样品制备和保存过程中，应防止样品受到污染或者发生残留物含量的变化。

8 测定步骤

8.1 提取

8.1.1 动物肌肉、内脏、肠衣

  称取2.0 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL 离心管内。加入0.1mL 内标液（5.20）、10 mL

0.02 mol/L乙酸铵溶液（5.14）和0.05 mLβ-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶溶液（5.10）均质（6.9）提取1 min，涡旋混合3 min，置于37 ℃±2 ℃水浴锅（6.3）振荡酶解16 h，4 ℃条件下10 000 r/min下离心5 min，转移全部上清液与一新离心管内，加入15 mL 正己烷（5.4）涡旋混合3 min，4 ℃条件下10 000 r/min下离心5 min，弃去上层正己烷，制得样品提取液待净化。

8.1.2 牛奶

  称取2.0 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL 离心管内。加入0.1mL 内标液（5.20）、10 mL

0.02 mol/L乙酸铵溶液（5.14）和0.05 mLβ-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶溶液（5.10）涡旋混合3 min，置于37±2℃水浴锅（6.3）振荡酶解16 h，-18 ℃下冷冻10 min，4 ℃条件下10 000 r/min下离心3 min，转移全部上清液，加入15 mL正己烷（5.4）涡旋混合3 min，4 ℃条件下10 000 r/min下离心5 min，弃去上层正己烷，下层液体经滤纸（5.23）过滤，并用2 mL乙酸铵溶液（5.14）洗涤滤纸，合并滤液制得样品提取液待净化。

8.2 净化

  转移全部样品提取液进行固相萃取柱（5.22）净化，使液体流速小于1.0 mL/min，待样品提取液全部通过后，依次用 3 mL水、3 mL甲醇淋洗固相萃取柱，保持抽干1 min，用4 mL洗脱溶液（5.15）洗脱，收集流出液，并于40 ℃氮气流下吹干。准确加入2 mL乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶9，体积比）（5.13）溶解残渣，经0.22 μm 滤膜（5.23）过滤，滤液供液相色谱-质谱/质谱测定。

8.3 测定

8.3.1 液相色谱仪器条件

液相色谱条件如下：

a）色谱柱：C18 柱，100 mm×2.1 mm（内径），粒径1.8 μm，或性能相当者；

b）柱温箱：25 ℃；

c）进样量：5 μL；

d）流速：0.3 mL/min；

e）流动相梯度洗脱程序见表1；

8.3.2 质谱条件

质谱条件如下：

a）电离方式：电喷雾（ESI+）；

b）扫描方式：正离子扫描；

c）检测模式：多反应监测（MRM）；

d）雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件及监测离子对（m/z）参见表A.1。

8.3.3 定性测定

  按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和内标混合标准工作液，试样中目标化合物的保留时间与内标混合标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在±2.5%之内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质混合标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，且每个离子的信噪比均≥3，则可判断试样中存在相应的被测物。

8.3.4 定量测定

  本方法苯乙醇胺A 采用同位素内标法定量测定，根据样液中被测物的含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液。标准溶液和样液中苯乙醇胺A 的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述仪器条件下，苯乙醇胺A 的参考保留时间为6.14 min。苯乙醇胺A 的MRM 图参见附录B。

8.3.5 空白试验

  除不称取试样外，均按上述测定条件和步骤进行。

9 结果计算与表述

用LC-MS/MS数据处理系统或按公式（1）计算试样中苯乙醇胺A 的残留量：

式中：

X——试样中苯乙醇胺A 的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

c——标准工作溶液中苯乙醇胺A 的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

ci——样品中内标物苯乙醇胺A-D3 的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

A——样品中苯乙醇胺A 的峰面积；

A_si——标准工作溶液中内标物苯乙醇胺A-D3 的峰面积；

V——样品定容液体积，单位为毫升（mL）；

c_si——标准工作溶液中内标物苯乙醇胺A-D3 的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

Ai——样品溶液中内标物苯乙醇胺A-D3 的峰面积；

As——标准工作溶液中苯乙醇胺A 的的峰面积；

m——最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）。

计算结果需将空白值扣除结果，结果保留3位有效数字。

10 定量限与回收率

10.1 定量限

  本方法的定量限为0.5 μg/kg。

10.2 回收率

  样品的添加浓度及回收率的试验数据见表C.1。