γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性检测试剂盒
(可见分光光度法)
产品货号:BA1031
产品规格:50管/24样
产品内容:
试剂一:液体40mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存。临用前加14mL蒸馏水充分震荡溶解,用不完的试剂-20℃分装保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1支,4℃保存。临用前加3.5mL蒸馏水充分震荡溶解。
试剂四:液体16mL×1瓶,4℃保存。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入30mL蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入1.0mL浓硫酸(自备),边加边搅拌。
标准品:液体1mL×1支,4℃保存。1μmol/mL磷标准溶液。
产品说明:
GCL(glutamate cysteine ligase)是GSH合成的限速酶,GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同时ATP去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出GCL活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
二、GCL测定操作:
1. 分光光度计或酶标仪预热30min,调节波长到660nm,蒸馏水调零。
2. 将标准液用蒸馏水稀释成0.1μmol/mL 磷标准溶液。
3. 加样表:
试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 240 | 240 | ||
试剂二 | 260 | 260 | ||
试剂三 | 60 | 60 | ||
样本 | - | 120 | ||
混匀后盖紧,37℃水浴准确反应15min; | ||||
试剂四 | 300 | 300 | ||
样品 | 120 | - | ||
混匀后,室温(25℃左右)10000rpm,离心10min; | ||||
上清 | 500 | 500 | - | - |
磷标准品 | - | - | 500 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 500 |
试剂五 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀后盖紧,45℃水浴10min,冷却后测定660 nm处光吸收,尽快测完。计算ΔA测=A测定管-A对照管, ΔA标=A标准管-A空白管。 |
三、GAL活性计算:
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL(U/mg prot)=[ΔA测÷(ΔA标÷C标准液)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷Cpr
(2)按样品鲜重计算
活性单位定义:37℃下,每克样品每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL(U/g鲜重)=[ΔA测÷(ΔA标÷C标准液)×V反总]÷(W÷V样总×V样)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:37℃下,每104个细胞每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(U/104 cell)=[ΔA测÷(ΔA标÷C标准液)×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义:37℃下,每毫升液体每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(U/mL)= [ΔA测÷(ΔA标÷C标准液)×V反总]÷V样÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标
V反总:反应总体积,0.98mL;V样:加入样品体积,0.12mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,15min,C标准液:磷标准溶液浓度,0.1μmol/mL;V样总:加入试剂一的体积,1mL;W:样品鲜重,g;细胞数量:以104为单位计算,万个。
注意事项:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,以免影响其活力。如果是匀浆液,避免反复冻融。
(2)样本测定前先取1-2个样做预实验,如吸光值大于1,应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数,哺乳动物组织和血液一般稀释3~5倍。
(3)细胞中GCL活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GCL的提取时可加试剂一(或生理盐水)后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
(4)试剂三配制完成后,请一周内使用完。
(5)试剂五配制过程中,可能会产生黑色固体,其不影响结果,注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色,若为蓝色则已污染,不可再使用。
(6)测定吸光值时请于水浴后10~40分钟内测完。
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