关于液相色谱柱使用中的常见问题解答

1. 反相色谱柱，初次使用如何活化？

采用纯有机试剂（如甲醇、乙腈），从0.1mL/min流速慢慢提高到正常使用流速，冲洗总体积以20倍柱体积为宜，以便固定相

能充分润湿、碳链舒展良好，使色谱柱的性能达到最好状态，并观察压力和基线状态。

柱体积计算参照公式：

柱体积=π*（I.D./2）2 *L*60%

常见的色谱柱规格的柱体积计算如下：

色谱柱规格                 色谱柱柱体积(mL)               20柱体积(mL)

2.1*50 mm                        0.102                               2.04

2.1*100 mm                       0.21                                 4.2

4.6*150 mm                       1.5                                   30

4.6*250 mm                      2.52                                 50.4

HILIC模式色谱柱如何清洗保存？

采用HILIC模式对样品进行分离分析，一般用于分离大极性化合物，因此对于极性大、吸附太强的杂质，常规清洗效果不明显，可以加大水比例，增加洗脱强度，先用纯水：乙腈=50:50，清洗20倍柱体积，然后梯度过渡到95%乙腈清洗，并最终保存在该流动相中。

什么情况下反冲？多采用什么方法反冲？

当流动相中使用了时间长，且缓冲盐使用较多；或者等度高比例水相一段时间造成了柱头严重污染，常规的冲洗难以达到一个好的效果，此时可以进行反冲。

反冲程序为0.3%的磷酸乙腈水（900mL乙腈+100mL水，再加3mL磷酸），反接色谱柱，0.5mL/min，冲洗2h，或者过夜处理。

选择保护柱应该注意什么？保护柱怎么再生？

除非特殊情况，一般选择填料基质与分析柱基质相同的保护柱保护柱，确保，确保分离选择性一致；规格选择方面，尽量选

择粒径一致或者相近的保护柱，且耐压符合要求，保护柱体积按分析柱体积的5%~10%，保护柱内径应与分析柱内径相同或相当。

保护柱的再生一般采用，取下保护柱，在不打开卡套的前提下将保护柱反接（注意此时不能接色谱柱），用10%甲醇水冲洗

30min，然后再用纯甲醇冲洗30min。

反相色谱分离分析中，流动相添加四氢呋喃有什么作用？四氢呋喃对于色谱柱和仪器有什么影响吗？

四氢呋喃（THF）在反相色谱中，洗脱能力比甲醇和乙腈要强。实验结果表明，在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质的分离度及峰形。

但是THF也存在不稳定，易降解生成过氧化物，从而导致峰形拖尾、峰分裂以及鬼峰；同时过氧化物还可与填料发生化学作用，一定程度上，THF会对柱子造成损伤，而且这种损伤随着时间而累积；再者THF对PEEK有腐蚀作用，因此添加浓度一般不超过20%。