本文要点：相较于近红外一区（NIR-I, 650-900 nm），近红外二区（NIR-II, 1000-1700 nm）窗口的光声（Photoacoustic, PA）和荧光双模态成像具有允许曝光高、自身荧光低和穿透深度大等优点而获得了广泛的关注。然而，由于缺乏合适的材料，在NIR-II激发下主动靶向胶质瘤的NIR-II PA/NIR-IIa（1300-1400nm）荧光成像却少有报道。

本研究制备了一种靶向αvβ3的NIR-II光声/NIR-IIa小分子荧光探针IR-32p，并使用U87MG荷瘤小鼠评价其成像效果。在1020/1064 nm激发下，在原位胶质瘤模型中表现出良好的肿瘤摄取、高靶向特异性等特殊的双模成像特性，显示出可穿透颅骨获得优异的成像结果。本研究同时还证实了在体内NIR-II PA/FL成像中，NIR-II激发优于NIR-I。

近红外二区小动物活体荧光成像系统

将αvβ3整合素结合肽环cRGDfK与N3-PEG16-COOH的羧基端偶联，生成N3-PEG16-cRGDfK，所得的加合物N3-PEG16-cRGDfK通过铜催化的叠氮化物-炔环加成的键合反应与5H5偶联，就得到了化合物IR-32p。

IR-32p因与PEG连接而具有良好的水溶性，能在水溶液中自组装形成稳定有序、尺寸分布均匀（d=10.0±3.0 nm）的球形胶束。IR-32p在水中的吸收波长为1094 nm，发射波长为1120 nm。同时在水中表现出强烈的NIR-I和NIR-II PA信号，且信号强度随浓度的增加具有良好的线性关系，在800-890 nm处的强度比在1000-1100 nm处的强度高约30%。在不同培养基中几乎保持了一致的荧光/PA强度，并显示出优异的稳定性，这有利于体内外的长期跟踪。

图1. IR-32p的合成路径、水中的光学性质、稳定性

由于IR-32p在NIR-I和NIR-II激发下均有强烈PA信号，作者进而比较了在NIR-I和NIR-II激发下，IR-32p成像的生物组织穿透深度。尽管随着成像深度增加，两种激发的PA成像信号背景比（SBR）均显著降低。但相同条件下，NIR-II PA成像（1020nm激发）始终显示出比NIR-I（800nm激发）更高的SBR。IR-32p在NIR-II窗口的穿透深度超过2cm，足以支持体内成像。

图2. IR-32p穿透深度测试的实验装置及结果

IR-32p对体外细胞（U87MG和NIH/3T3）具低光毒性；即使5倍成像浓度也不会使小鼠主要器官引起器质性病变，不影响血常规及肝肾功能。总之，体内外安全性实验均显示IR-32p具有良好的生物相容性，这支持了作者进行小鼠体内胶质瘤成像。

图3. IR-32p的体内外生物相容性

使用IR-32p进行皮下原位U87MG胶质瘤的体内NIR-IIa荧光成像，同时使用IR-32p+cRGDfK共注射作为阻断组以评估IR-32p对整合素αvβ3受体的特异性（cRGDfK注射剂量为IR-32p的10倍以竞争αvβ3受体）。在3h时开始有明显可区分的信号，强度在6h，比阻断组高约2倍；而阻断组肿瘤荧光信号在各时间点均有降低，其轻微的信号积累可能归因于EPR效应。

另外，分别进行NIR-I和NIR-II激发下的体内PA成像，PA信号均在5 h时，且明显高于阻断组，与荧光成像一致；但在1020 nm处可观察到更高的对比度。

以上结果说明了IR-32p具有出色的主动靶向能力，积累量高，可实现清晰、快速的肿瘤可视化。

图4. 皮下原位胶质瘤NIR-II PA/NIR-IIa荧光成像

在出色的皮下成像质量的激励下，作者研究了IR-32p对原位脑胶质瘤模型的双模态成像能力。在U87MG正位脑胶质瘤小鼠模型中，IR-32p作用后3 h，肿瘤部位即可见清晰的荧光信号，6 h内荧光信号逐渐增强，达到超高对比度；并且在去除头皮后，大脑和胶质瘤的形态更加清晰。这表明了IR-32p克服完整颅骨和头皮屏障的深组织穿透能力。

离体生物分布研究发现IR-32p主要在肝脏、脾脏和肾脏中积累，表明了其肝脏和肾脏的清除途径。离体脑图像还进一步证实了IR-32p特异性靶向αvβ3的能力。

图5. 原位脑胶质瘤NIR-II荧光成像

最后，利用NIR-II PA来评估脑胶质瘤的精确位置信息，充分说明了NIR-II 激发相较于NIR-I激发的优势：当激发光从800 nm切换到1020 nm时，颅骨和头皮的强信号几乎消失；在NIR-II PA成像中，从胶质瘤中心点到颅骨的深度和高度可准确地测量，取得与MRI一致的结果；在代表性图像中，NIR-II PA成像的肿瘤与正常组织之比（T/NT）约为NIR-I PA成像的8倍。

阻断实验中，24 h内未检测到胶质瘤的明显PA信号，验证了IR32p对胶质瘤的主动靶向能力。根据H&E染色，IR-32p处理组和阻断组胶质瘤的面积、大小和形态与MRI或NIR-II PA成像结果一致。这些结果进一步证实了NIR-II相对于NIR-I PA成像在原位胶质瘤成像中的优越性。

图6. 原位脑胶质瘤NIR-I / NIR-II PA成像

总之，本研究合理设计并合成了小分子αvβ3靶向NIR-II PA/NIR-IIa探针IR-32p，用于NIR-II激发下胶质瘤的靶向成像。IR-32p的宽带吸收使得NIR-I和NIRII的PA成像成为可能。IR-32p具有优异的生物相容性和优越的光物理性能，可在NIR-II激发下对U87MG皮下胶质瘤进行NIR-II PA/NIR-IIa荧光双模成像，比NIR-I激发具有更深的穿透性和更高的肿瘤靶向对比度，使IR-32p成为未来临床应用中深部原位脑胶质瘤检测的有希望的候选者。

参考文献

Lyu S, Lu S, Gui C, Guo C, Han J, Xiao Y, Zhang R, Hong X. A NIR-II Photoacoustic/NIR-IIa Fluorescent Probe for Targeted Imaging of Glioma under NIR-II Excitation. J Med Chem. 2024 Feb 8;67(3):1861-1871

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近红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

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