体内药效评价&药理学研究

抗肿瘤药物药效学评价

抗肿瘤药物药效学评价是小动物光学成像技术的基础应用之一，利用荧光素酶标记肿瘤细胞，并移植入动物体内建立肿瘤疾病动物模型，给药后应用小动物活体光学成像技术观测肿瘤光学信号随时间的变化情况，进而评价不同药物、特定的给药途径、时间、剂量等给药策略对于肿瘤的治疗效果，如下图就利用小动物活体光学成像技术评价了PD-0332991(PD-991)、阿瓦斯汀（Avastin）、多西他赛（docetaxel，TXT）的抗肿瘤效果。

利用萤火虫荧光素酶标记MDA-MB-435乳腺癌细胞株，将细胞注入小鼠肾包膜下构建肾包膜肿瘤模型，进而对3种不同药物或不同剂量的治疗效果进行评价。（A,C）应用IVIS成像系统长期观测3种药物对肾包膜乳腺癌移植瘤的治疗效果，并进行定量分析，结果显示30 mg/kg Docetaxel（TXT）对肿瘤的生长抑制效果好；（B,D）应用IVIS成像系统长期观测3种药物对肾包膜乳腺癌移植瘤肺部转移的抑制效果，并进行定量分析，结果显示30 mg/kg Docetaxel（TXT）对肿瘤转移的抑制效果好。

Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.

利用生物发光成像技术进行药效评价的另一优势在于，可以明确判断药物是否有效杀死肿瘤活细胞。这是由于生物发光的原理是基于活细胞环境的酶促反应，因此，能够发光的细胞必定是具有活性的。下图所示为辉瑞公司抗肿瘤药物Sutent的部分研究结果，研究人员首先利用卡尺测量肿瘤体积的方法观测该药物对于肿瘤的生长抑制情况，发现该药物能够延缓肿瘤的生长，但体积测量数据显示肿瘤并未变小，研究人员随后利用生物发光成像技术进行观测，发现给药一定时间后肿瘤光学信号显著降低，说明该药物对肿瘤活性细胞确实具有杀伤作用，同时说明单独依靠肿瘤体积测量的方式无法准确真实反映药物治疗效果。凭借活体光学成像的实验结果，Sutent得以顺利通过FDA的认证。

IVIS Lumina III小动物光学活体成像系统

该系统进一步优化了荧光二维成像性能，将滤光片标准配置数量增加至26个，引入了作为荧光多光谱成像金标准的纯光谱分析技术（CPS），使得Lumina III成为同时拥有生物发光及荧光二维成像金标准的高性能活体成像平台。

• 高灵敏度生物发光二维成像

• 高性能荧光二维成像,配备高品质滤光片及光谱分离算法，可实现自发荧光扣除及多探针成像

• 生物发光及荧光成像模式联合使用

• 基于切伦科夫辐射原理的放射性同位素成像

D-萤光素钾盐

来自逐典的D-萤光素是常用和多功能的生物发光底物。利用荧光素基因标记细胞，注射荧光素底物后检测荧光强度，可实时监测目的细胞的生长状况与药物使用效果。

小动物活体光学成像实验流程，主要分为：

1，选择合适的荧光素酶；

2，进行载体构建

3，建立稳转细胞系；

4，细胞注射动物；

5，注射底物；

6，进行活体成像

萤火虫萤光素酶标记肿瘤细胞株的构建可以采用电转染方式。

Lonza Nucleofector核转系统

Nucleofector技术是—种基于通过施加电脉冲在细胞膜中瞬间产生小孔，综合各种Nucleofector严程序和细胞类型特异性电转试剂，使核酸底物不仅可以输送到细胞质，还可以通过核膜进入细胞核。这使得细胞最高转染效率可达99%，并使转染成功不依赖千细胞的增殖分裂。无论是原代细胞、干细胞、还是细胞系，它每次都可重复出很高的转染效率，更高效筛选出稳定转染的肿瘤细胞珠。

药物分布靶向研究

除了在药效学中的应用，小动物活体光学成像也广泛应用于药物在体内靶向、分布及代谢的研究。与药效学中的应用不同，此类应用是以药物为直接观测对象，因此标记方式通常是利用荧光探针直接标记药物本身，通过追踪荧光信号而反映药物在体内的分布情况。如在研究抗体或多肽类药物是否能够有效靶向肿瘤的实验中，可以利用荧光染料通过化学键的结合标记目标抗体或多肽，经尾静脉注射后，利用小动物活体光学成像系统观测上述标记对象的肿瘤靶向性，如下图：

上图：利用VivoTag 645荧光染料标记抗癌药物曲妥珠单抗(Trastuzumab)，尾静脉注入携带HER2阳性人卵巢癌SKOV3的SCID小鼠体内，通过荧光成像观测不同时间点药物对肿瘤的靶向情况（左上图后三列），肿瘤本身已被荧光素酶标记而通过生物发光成像（左上图最左列），右上图为荧光定量分析结果，标明曲妥珠单抗对HER2阳性的人卵巢癌SKOV3具有良好靶向性。

在研究药物靶向的同时，了解不同时间点药物在动物体各个器官的分布及最终代谢情况同样。Revvity小动物活体荧光断层成像系统可以很好的满足此类应用需求，能够对荧光标记的药物在深层器官的分布进行断层扫描及三维重建，获得真实准确的三维定量数据，进而对药物的体内分布代谢情况作出正确分析。如下图：

上图左：利用FMT 成像系统观测不同时间点经荧光染料VivioTag 680 标记的BSA 在小鼠不同器官的分布； 上图右：不同时间点不同器官BSA 分布的定量结果。

Revvity小动物活体成像系统Spectrum产品系列能够进行生物发光和荧光的三维重构成像，从而更为有效地提供信号的深度、大小和精确定量的信息，更为严谨、全面地观察小动物体内生物学反应，完成小动物活体成像系统从二维到三维成像、从相对定量到精确定量的飞跃。IVIS Spectrum CT同时具备功能性及结构性成像功能，使研究人员能够更全面的了解活体动物体内复杂的生物学现象。

功能性成像包括:

(1)三维生物发光成像;

(2)三维荧光成像;

(3)三维切伦科夫成像:

结构成像包括:

(1)活体动物断层扫描功能;

(2)影像重建功能;

(3)适合进行高通量成像;

(4)荧光多光谱成像;

CAR-T细胞药物毒性研究

CAR-T细胞是通过识别并靶向肿瘤细胞表面抗原从而杀死肿瘤细胞。遗憾的是，CAR-T细胞针对的靶抗原多为肿瘤相关抗原（TAA），并非肿瘤细胞所的，在正常组织上也存在不同程度的表达。此时对靶抗原亲和力和杀伤能力强的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也会攻击正常组织，造成组织器官的损伤。

在FDA发布的《细胞治疗临床前动物实验指南》中也提到， 需要使用适当的动物模型来预测临床反应。 然而多数情况下，因为靶抗原在跨物种反应中存在差异性，目前用于CAR-T药理试验的动物模型，并不符合这一标准。因此，临床前动物研究很难预测临床潜在的不良反应，同时会造成一种安全的假象。因此，急需一种在正常组织中表达人类靶点的动物模型， 来预测脱靶毒性，并提高免疫治疗的安全性。

为了解决这个问题，Carl H. June教授团队开发了一种小鼠模型，该模型能够在正常肝组织上稳定可调的表达人类靶抗原。并以表达人表皮生长因子受体-2（Her2）为例展开了研究，同时比较了不同亲和力CAR-T 细胞的抗肿瘤效果及毒性。相关结果发表在《JCI Insight.》期刊上。

研究人员设计了肝脏高/低抗原表达的两组小鼠，注射相对高/低亲和力的CAR-T细胞，随后通过体重、血清样本、临床毒性信号及活体成像信号等指标来评价不同亲和力CAR-T的毒性反应。结果显示，在肝脏低Her-2表达的小鼠中，高亲和力的CAR-T疗法是非致死的，而异种排斥反应才是主因(下图B)。肝脏低表达小鼠的毒性降低，死亡率降低(下图C)，亲和调节的CAR-T的死亡率没有显著差异(图C)，但高亲和力CAR-T细胞更容易造成肝脏损伤（下图D）及体重的降低（下图E）。通过IVIS生物发光成像评估两种亲和力CAR-T细胞的丰度差异，结果显示在阴性对照小鼠在注射T细胞后的前2周内，CAR-T细胞的数量保持不变，表明缺乏抗原依赖性激活。在低抗原表达小鼠中，抗原识别时间延长，高亲和力组保持激活时间更长。总的来说，低亲和力 CAR-T细胞在该动物模型中能够更好地区分低抗原密度和高抗原密度组织，表现出更好的安全性。

CAR-T非肿瘤靶向引起毒性评价