细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

 细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂是一种旨在使用化学发光分子光泽精受到NADPH氧化酶催化产生的超氧阴离子O₂^-的还原，然后在其还原过程中释放能量，由此测定样品中特异性氧化还原酶（oxidoreductase）的活性，即采用发光探测仪（Luminometer）测定其相对冷光单位（RLU）的变化，以此进行测算酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞样品（动物或人体）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

NADPH氧化酶，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激活，将还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转变为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），氧分子则获得电子形成超氧阴离子O₂^-，由O₂^-又可生成H₂O₂和OH^－。其超氧阴离子产物具有杀死微生物的功能。NADPH氧化酶异常将导致慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物NADPH，受到NADPH氧化酶的催化作用，产生超氧阴离子O₂^-，进而超氧阴离子将化学发光分子光泽精（lucigenin）还原，并释放能量，通过发光探测仪（Luminometer；470nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的活性。其反应方式为：   

产品内容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  缓冲液（Reagent C）         毫升

  反应液（Reagent D）         微升

  阴性液（Reagent E）           毫升

  底物液（Reagent F）          毫升

  专性液（Reagent G）           微升

产品说明书                1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；  反应液（Reagent D）和  底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

微型台式离心机：用于样品制备

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育

专用测定杯或黑色96孔板：用于冷光测定的容器

化学发光仪：用于冷光分析

实验步骤

测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为30℃预热和运行程序（清洗步骤等），然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；  反应液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管，置于冰槽里——此为细胞总蛋白

15． 同时加入xx微升  裂解液（Reagent B）到颗粒管

16． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

17． 在冰槽里用研磨棒匀化组织颗粒（约80下）

18． 转移到到另一个新的预冷的1.5毫升离心管——此为细胞膜蛋白

19． 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－   30030.1）

20． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 从-70℃取出上述制备的待测样品，置于冰槽里（注意：检测前样品须澄清；参见注意事项7）

2．   缓冲液（Reagent C）室温下预热

3． 设定好化学发光仪（温度为30℃）：整合10秒，间隔1分钟，测定5分钟，并置零（注意：参见注意事项9）

三、 背景对照测定（选择步骤）

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的专用测定杯

2． 加入xx微升  反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放进30℃培养箱里孵育3分钟

5． 加入xx微升  阴性液（Reagent E）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放进化学发光仪里

8． 整合10秒，测读5分钟，获得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）读数，此为背景空对照

四、样品总活性测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的专用测定杯

2． 加入xx微升  反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放进30℃培养箱里静置3分钟

5． 加入100微升待测样品（注意：300微克细胞膜蛋白或500微克细胞总蛋白；样品须溶解；参见注意事项7）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放进化学发光仪里，

8． 整合10秒，测读5分钟，获得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）读数，此为样品总活性

五、样品非特异活性测定（选择步骤）

1． 准备1个1.5毫升离心管

2． 加入xx微升  专性液（Reagent G）

3． 加入100微升待测样品（注意：300微克细胞膜蛋白或500微克细胞总蛋白；样品须溶解；参见注意事项7）

4． 放进30℃培养箱里静置5分钟

5． 放进冰槽里备用

6． 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的专用测定杯

7． 加入xx微升  反应液（Reagent D）

8． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

9． 放进30℃培养箱里静置3分钟

10． 加入上述冰槽里的xx微升含有  专性液（Reagent G）和待测样品的溶液

11． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

12． 即刻放进化学发光仪里

13． 整合10秒，测读5分钟，获得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）读数，此为样品非特异活性

六、 样品活性分析

1．计算公式

2．绘制RLU读数（Y轴）和时间（X轴）关系曲线

注意事项

1． 本产品为21次（10个样本）操作，包括1次背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3．   反应液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光

4． 测读的所有步骤均须在暗室里进行

5． 系统操作过程中，背景测定只需1次

6． 背景测定和样品非特异活性测定可以省略

7． 样品检测前，须溶解和澄清 

8． 加入样品启动反应后3秒内即刻测定

9． 反应测定值随着时间增加而逐渐升高，通常5分钟达到峰值，并趋于稳定；如果继续升高，测定可以持续15分钟

10． 测定值由低到高变化，表明有酶活性

11． 测定后，专用测定杯须清洗

12． 建议待测样本总蛋白浓度为500微克/100微升（300微克膜蛋白+200微克总蛋白）或纯化细胞膜蛋白为300微克/100微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒   30030.1）

13． 如果检测纯化细胞膜蛋白的酶活性，可以加入花生四烯酸（Arachidonic Acid）激活处理

14． 样品实际活性是指超氧化物歧化酶敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干扰因素

15． 本公司提供系列氧化酶类技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确