在复发性和难治性B细胞恶性肿瘤的治疗中,应用CD19 CAR-T细胞疗法取得有效应答，而FDA批准的4种CD19 CAR-T细胞产品，在新的随访数据中发现，只有30%-50%的患者实现了疾病的长期控制。为了提高B细胞恶性肿瘤的应答率，并将CAR T细胞的成功转化到实体瘤，故需对此类治疗方法进行优化。

国外研究人员在Nature communications 期刊发表了题为The IgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves VHH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer的研究论文，通过设计靶向GPC1的CAR细胞，主要用于胰腺癌的治疗。

Glypican-1 (GPC1)是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定的细胞表面蛋白。在胚胎发育期间主要在神经和骨骼系统中表达，并在成人组织中低水平表达。多项研究表明，GPC1在胰腺癌组织及癌旁成纤维细胞中表达升高，而在正常胰腺组织中表达很少。抗GPC1单克隆抗体已被用于开发抗体-药物偶联物(ADC)、免疫毒素、双特异性T细胞结合物(BiTE)和抗GPC1阳性肿瘤细胞的CAR-T细胞，并且抗肿瘤效果已在临床前模型中得到证实。

GPC1在胰腺癌中表达水平是不同的，在阳性的胰腺肿瘤组织中，GPC1弱阳性占51.4%，中度阳性占35.1%，强阳性占13.5%。抗原密度已成为影响CAR-T细胞活性的主要因素。CAR-T细胞的效力高度依赖于靶抗原的表达，当抗原表达水平较低或低于一定阈值时，CAR-T往往无法发挥其抗肿瘤活性

作者首先分离了一株单峰骆驼抗GPC1 VHH抗体D4(也称为纳米抗体)和一株单克隆抗体HM2 (mAb)，分别识别GPC1的膜远端和膜近端表位（图1），并通过多组实验比较二者在疗效上的区别。

图1：D4-VHH和HM2抗体的发现

使用IVIS活体成像系统，实验结果显示，在两种药物处理细胞和小鼠后，发现D4 VHH和单克隆抗体HM2均可促进有效的肿瘤杀伤和整体持久性，并且D4 VHH CAR-T细胞比HM2 CAR-T细胞多分泌2-7倍的细胞因子，包括IFN-γ、IL-2和TNF-α。所以D4 VHH-CAR-T具有更好的肿瘤清除率（图2），值得更进一步的研究。

图2：HM2和D4 CAR处理后的小鼠肿瘤模型

由于GPC1靶向的CAR对低GPC1表达的T3M4癌细胞显示出适度的抗肿瘤活性，而基于D4 VHH的CAR易表达，其转导效率比基于HM2的CAR高近40%。所以作者设计了基于D4 VHH的GPC1 CAR。作者将45个氨基酸的CD8H替换为短的12个氨基酸修饰的IgG4H。为了充分研究间隔区长度对CAR-T细胞活化的影响，又构建了两个额外的D4 CAR，其中依次添加修饰的IgG4-Fc间隔区，得到D4-IgG4H-CH3（中）和D4-IgG4H-CH2CH3(长)。这三种基于D4-IgG4H的CAR都含有CD28 TM结构域。

使用IVIS活体成像系统，比较了不同间隔长度CAR-T细胞的抗肿瘤活性。发现IgG4H的D4 CAR-T细胞治疗小鼠，在治疗2周内肿瘤迅速消退。同样剂量表达中间隔或长间隔的D4 CAR-T细胞在消除小鼠癌细胞方面效果较差（图3）。总之，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞在低GPC1抗原密度的胰腺癌细胞中显示出增强的抗肿瘤效果。

图3：D4-IgG4H-CD28TM和不同间隔长度的CAR-T细胞抗肿瘤活性

紧接着作者又研究了抗GPC1抗体克隆1-12的GPC1 CAR-T细胞的抗肿瘤作用。D4-IgG4H-CD28TM和克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR的表达通过hEGFRt表达和GPC1结合，与hEGFRt表达(67%)相比，通过GPC1结合测定的D4 CAR表达(58%)有小幅下降。通过检测任一标记，克隆1-12 CAR显示出相同的表达水平(60%)。与D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞相比，克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞的CD8+T细胞百分比略高。同步比较了D4和IgG4H-CD28TM CAR构建中克隆1-12对低表达GPC1的胰腺癌细胞的杀伤效果。

使用IVIS活体成像系统，对Panc-1原位胰腺癌小鼠模型评估了两种CAR的疗效。截至第2周，D4-IgG4H-CD28TM和克隆1-12-IgG4H CD28TM CAR-T细胞均以相当的疗效诱导肿瘤消退。并且在第4周，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞对肿瘤达到100%杀伤。

图4：对Panc-1原位胰腺癌小鼠模型进行评估

此外，在T3M4 i.p异种移植小鼠模型中，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞更有效地抑制肿瘤生长，比克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力更强（图5）。最后,D4-IgG4H-CD28TM CAR-T对肿瘤细胞的杀伤效果，也在Bxpc3 ip异种移植小鼠模型得到了同样的趋势(图5)。证明了D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞比克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞有着更有效的抗肿瘤功效。

图5：分别在T3M4 i.p和Bxpc3 i.p异种移植小鼠模型中观察抗肿瘤功效

作者最终证明用较短的IgG4H替代较长的CD8H可显著改善D4 CAR-T细胞的活性。此外，通过研究H (CD8和IgG4)和TM (CD8和CD28)对D4 CAR-T细胞的影响，发现IgG4H-CD28TM介导D4 CAR二聚化，导致低抗原密度胰腺癌模型中T细胞信号传导增强和肿瘤消退。此外，高功能的CD8+ D4-IgG4H-CD28TM CAR-T细胞分泌更多的IL-2和IL-7，并表现出对T细胞长期持续存在重要基因(例如ID1)的表达增加。这项工作提供了一种策略来优化膜远端表位的识别，并改善基于纳米抗体的CAR T细胞在实体瘤中的功能。

参考文献

Nan Li,Alex Quan,Dan Li,Jiajia Pan,Hua Ren,Gerard Hoeltzel,Natalia,Val,Dana Ashworth,Weiming Ni,et al.The IgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves VHH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer. Nature Communications 14, Article number: 1986 (2023)