石蜡切片神经组织金属锌蒂姆（TIMM）染色试剂盒产品说明书（中文版）

 石蜡切片神经组织金属锌蒂姆（TIMM）染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  石蜡切片神经组织金属锌蒂姆（TIMM）染色试剂是一种旨在使用标准化的化学分离石蜡方法和蒂姆硫化法银染技术，分析存档中的石蜡包埋的组织切片中神经系统中含锌神经细胞结构的而经典的技术方法。该技术经过精心改良蒂姆（Timm）方法、成功实验证明的。主要适用于石蜡包埋的脑组织或外周神经组织切片，例如海马（hippocampus）中苔藓纤维区（mossy fiber region）和齿状分子层（dentate molecular layer）等含锌神经细胞体，例如锥体细胞（pyramidal cells）、齿状颗粒细胞（dentate granule cells）等检测。广泛用于脑理生理，尤其是癫痫等疾病的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

蒂姆硫化法银染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于观察脑组织和其它组织中（例如胰腺、小肠、睾丸、肾脏等）微量金属元素锌，以及其它重金属元素，例如铜、镍、钴和铁等的染色技术。主要用于观察中枢神经系统中含锌神经元，以及新轴突分枝（sprouted axon）和轴突终端（axon terminal）等结构，分析大脑灰质内部的海马中轴突终端（突触泡囊synaptic vesicle）、苔藓终端（齿状颗粒细胞dentate granule cells）中的反应性锌的分布，与突触活性和膜去极化的关系，研究神经退行性和癫痫病理性变化机制。其原理在于使用硫化物，与组织中的游离金属元素反应成为不溶性复合物沉积，进而在还原剂的作用下，金属硫化物催化还原离子银为可见金属银沉积，呈现黑色，即为金属自显影术（autometallography，AMG）。

产品内容

  硫化液（Reagent A）           毫升

  固着液A（Reagent B）          毫升

  固着液B（Reagent C）              毫升

  脱蜡液（Reagent D）                毫升（自备）

  补水液A（Reagent E）          毫升

  补水液B（Reagent F）          毫升

  补水液C（Reagent G）          毫升

  清理液（Reagent H）           毫升

  染色液A1（Reagent I1）              毫升

  染色液A2（Reagent I2）              瓶

  染色液A3（Reagent I3）              毫升

  染色液B（Reagent J）          微升

产品说明书              1份

保存方式

保存  染色液A1（Reagent I1）在—20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证3月

用户自备

PBS缓冲液：用于灌注

无离子水：用于组织清洗

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

无菌镊子：用于转移动物脑组织

小型玻璃染色缸：用于组织或切片处理的容器

切片机：用于组织切片

明胶化载玻片和盖玻片：用于切片后铺片

中性树脂：用于切片封片

光学显微镜：用于切片染色后观察分析

实验步骤

一、 样本固着处理

1． 常规麻醉动物和手术（建议：使用PBS由心脏处灌注约5至10分钟，去除血液直至澄清，肝脏显示灰白）

2． 使用适量的  硫化液（Reagent A）灌注处理（建议：至少10分钟，肝脏显示发黑）

3． 即刻小心取出脑组织（组织显示蓝灰色调）

4． 小心放进xx毫升  硫化液（Reagent A）里

5． 室温下浸泡孵育45分钟

6． 即刻用无菌镊子夹起组织块 

7． 放进用户自备的无离子水清洗2分钟

8． 小心转移到xx毫升  固着液A（Reagent B）里

9． 室温下浸泡孵育过夜（16小时）

10． 小心转移到xx毫升  固着液B（Reagent C）里

11． 室温下浸泡孵育过夜（16小时）

12． 用绵纸吸干组织快

13． 即刻进行常规乙醇和氯甲烷（氯仿类）处理后石蜡包埋

14． 取出组织块，进行缓慢石蜡切片，为10至50微米厚，并铺片在明胶化载玻片上

二、 脱蜡处理

1． 取出10片待测的10至50微米厚的石蜡包埋的组织切片

2． 按下表依次放进小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

三、 样本染色处理

染色开始前，将  染色液A1（Reagent I1）置于室温下均衡温度，然后移取xx毫升  染色液A3（Reagent I3）到1瓶  染色液A2（Reagent I2），充分混匀后，再加入到1瓶  染色液A1（Reagent I1）中，充分混匀；然后移取2毫升染色液A混匀液到2.2毫升离心管，加入xx微升  染色液B（Reagent J），混匀后，标记为  染色工作液（10张切片染色），置于暗室里备用。然后进行下列操作

1． 小心加上xx微升  染色工作液，铺满整个切片样品表面

2． 室温下孵育60至90分钟，或直至呈现黑色，即可终止，避免光照

3． 小心移去切片上的  染色工作液

4． 室温下，小心将切片置入xx毫升  清理液（Reagent H）中孵育5分钟

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

6． （选择步骤）进行复染操作（建议使用  甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）复染试剂盒－GMS80052）

7． 透明处理

8． 放上盖玻片或封片（中性树脂）

9． 即刻在一般光学显微镜下观察：含锌神经细胞体，例如锥体细胞、齿状颗粒细胞、突触泡囊等，呈现黑色（如果复染――细胞核呈现蓝色，胞浆尼氏（体）物质呈现粉红至紫色）

注意事项

1． 本产品为10次操作，其中20次染色操作

2． 操作时，须戴手套

3． 铺片须使用明胶化载玻片，否则染色会掉片：第一用毛笔涂刷；第二保持湿润3小时；第三用PARAFIN包裹后压片

4． 切片建议10至50微米，过厚和过薄不利于检测神经细胞

5． 注意操作安全，尤其使用  固着液（Reagent B和C）和  脱蜡液（Reagent D）

6． 用户可以使用二甲苯替代  脱蜡液（Reagent D）

7． 建议使用玻璃染色缸

8．   染色液A混匀液新鲜配制，不宜保存

9． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干

10． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

11． 整个操作，在避光状态下进行

12． 染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 

13． 样品染色后保存，避免光照

14． 参考图像如下

15． 本公司提供系列神经系统成分染色试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰