细胞膜流动性（fluidity）PDA荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

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  细胞膜流动性（fluidity）PDA荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  细胞膜流动性（fluidity）PDA荧光检测试剂是一种旨在通过苯并芘癸酸荧光染料，选择性地与细胞膜整合，并与之产生空间交互作用，形成激基缔合物，其荧光散发波长的转移，即荧光比值的增强或减弱，来分析膜流动性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体或动物贴壁或悬浮细胞膜流动性的动力学检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

技术背景

细胞膜和细胞质微管以及微丝的动力学特征和微泡和囊泡内脂质的流动动力学，即流变学（rheological）细胞功能，受到细胞膜流动性（fluidity）或粘性（viscosity）调节，包括细胞膜酶系的活化，微管和微丝的特定装配或流动，化学引诱物受体亲和力的强化，膜结构和功能的作用等。一旦调节失衡，会导致病理演变或膜性变异。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）为多环芳香烃（polycyclic aromatic hydrocarbon）化合物，一种亲脂性苯并芘荧光探针染料，用于膜生物物理学研究：一，具有亲脂性； 第二，与细胞膜脂质具有类似性（analog），可以与细胞膜整合；第三，进入膜结构空间后，与之产生交互作用，形成激基缔合物（eximer），其荧光散发波长由372nm转移到470nm，通过缔合物和单体的荧光比值（ratio），分析膜流动性强弱，包括动力学，影响因子等。  

产品内容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀释液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

  强化液（Reagent D）            微升

产品说明书               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离操作

细胞培养液（GMS12052）：用于细胞脱落操作

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光定性分析

比色皿或黑色96孔板：用于荧光定量分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

细胞流式仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀释液（Reagent B）和  强化液（Reagent D）放进25℃恒温水槽里预热。然后分别移出xx微升  染色液（Reagent A）和xx微升  强化液（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，加入980微升  稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置（共5次操作量），并标记为  染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、直接法

1． 准备1个96孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约1 X 10⁵细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 轻轻沿着孔壁加入xx微升   清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心抽去  清理液（Reagent C）

5． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀释液（Reagent B）和  强化液（Reagent D）的  染色工作液，覆盖培养孔表面

6． 放进25℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

7． 小心抽去  染色工作液

8． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

9． 小心抽去  清理液（Reagent C）

10． 重复实验步骤8至9一次

11． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

12． 选择下列检测：

一、 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察

1） 单体荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长370nm，干涉滤波器405nm波长 ）――可见浅蓝色荧光；如果强度明显，表明膜流动性减弱

2） 激基缔合物（eximer）荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长470nm）――可见深蓝色荧光；如果强度显著减弱，表明膜流动性减弱

二、即刻在荧光酶标仪检测（激发波长350nm，散发波长370nm和470nm）：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流动性强

二、间接法

1． 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约2 X 10⁶细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心抽去xx毫升   清理液（Reagent C）

5． 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面

6． 置入37℃培养箱1分种

7． 轻轻抖动培养板，使细胞脱落，然后加入1毫升用户自备的细胞培养液

8． 移入1.5毫升离心管（注意：悬浮细胞从这一步开始）

9． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

10． 小心抽去上清液

11． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀释液（Reagent B）和  强化液（Reagent D）的  染色工作液

12． 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群

13． 放进25℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

14． 放进微型台式微型离心机离心5分钟，速度为1000g

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混匀细胞颗粒群

17． 放进微型台式微型离心机离心5分钟，速度为1000g

18． 小心抽去上清液

19． 重复实验步骤16至18一次

20． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混匀细胞颗粒群

21． 进行下列检测

选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察 

1． 混匀后，移出50微升在载玻片上

2． 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察：

1） 单体荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长370nm，干涉滤波器405nm波长 ）――可见浅蓝色荧光；如果强度明显，表明膜流动性减弱

2）激基缔合物（eximer）荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长470nm）――可见深蓝色荧光；如果强度显著减弱，表明膜流动性减弱

选择二、细胞流式仪分析

1. 混匀后，即刻进行细胞流式仪分析：观察5000个细胞以上

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

1． 混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻进行荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定（激发波长350nm，散发波长370nm和470nm）：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流动性强

注意事项

1． 本产品为20次（0.2毫升工作液）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长

4． 操作时，避免污染母液，尤其是  稀释液（Reagent B）

5． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析

6． 孵育时，避免光照

7． 本公司提供系列膜流动性检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰