一．为什么要进行抗体全长测序？

复原单克隆抗体重链和轻链序列的通用方法有两种。最直接的方法是对B细胞的转录子或遗传物质进行测序。该方法适用于杂交瘤，噬菌体展示，酵母菌展示或单细胞筛选，是抗体测序法中成本效益和的方法。但是，源细胞并不一定总是可用的。如果杂交瘤丢失，就可能无法获得遗传物质。在这种情况下，可以使用抗体测序来复原抗体序列，例如使用Edman降解或质谱分析技术。

二．抗体测序的分类

1.基于Edman降解法的测序：是一种成熟的蛋白质序列测定技术，该技术从N端开始，一次读取一个氨基酸。Edman降解法测序的主要优势是样品量要求低（通常需要少于1ug）。Edman降解法测序的质量随着氨基酸加工数量的增加而降低，因此该测序法通常用于确定前30-50个氨基酸，很少用于抗体全序列测定。

2.基于质谱的抗体测序法：将抗体分解成15-20个氨基酸长的肽，然后在质谱仪中进行分析。在理想情况下，每种肽都可产生片段图谱。进行抗体从头测序时，需要对每个片段图谱进行解析并揭示抗体的一部分序列。通常，我们用具有不同切割基序的多种酶来分解抗体，从而确保抗体的每个区域均可产生几个重叠肽。通过产出重叠肽，抗体测序技术可以以类似于法测序组装基因组的方式重组抗体序列。

3.肽谱分析和抗体从头测序：肽谱分析的目标是确认已知序列，抗体从头测序是从片段图谱或图谱集合中获得之前未知序列的过程。与抗体从头测序相比，肽谱分析需要的酶解次数和质谱运行次数往往更少，这就意味着花费可以更低。

三．蛋白质从头测序技术

蛋白质从头测序技术（De Novo Sequencing）是利用串联质谱（MS/MS）获取离子，根据两个片段离子之间的质量差来计算肽链上氨基酸残基的质量，从而得到蛋白的氨基酸序列的分析过程。该技术主要针对未知物种的基因组序列，构建不同类型的基因组DNA文库，并进行序列测定。然后通过生物信息学的方法对测序所得到的序列进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、以及真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。

四．从头测序技术实验流程

先对样品进行多酶解实验，将酶解后的肽段进行质谱检测，数据采集后的质谱图用de novo算法进行解析并获得对应的肽段序列，经过肽段间的比对拼接，从蛋白N端到C端拼装出来，得到蛋白的氨基酸序列。

目前可通过液相色谱与Obitrap Fusion高分辨质谱仪联用，建立蛋白从头测序（De Novo Sequencing）平台，保证了低丰度肽段碎裂片段鉴定的灵敏度，同时在肽段碎裂过程中采取HCD与ETD结合的碎裂模式，对亮氨酸/异亮氨酸这对同分异构体进行区分。

五．数据分析

（1）肽段覆盖率基于特异性和非特异性蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Glu-C、Lys-C、Pepsin、Elastase等）分别对蛋白样品进行酶切，使蛋白覆盖率达到100和产生丰富的、重叠度高的肽段类型，最终得到测序所需的高质量数据。

（2）肽段拼接采用HCD会产生一系列b/y离子，根据这些离子信息来推导肽段的序列。但是由于多种酶切会产生很多重复肽段，所以要对肽段进行一系列筛选。首先要选择高峰度的肽段，其实是判断肽段二级离子的碎裂。但是当碎片离子缺失时，数据库搜索可能仍然成功。故为了提高从头测序准确性，采用的方法可能结合不同离子片段化技术产生多个谱图。

（3）亮氨酸与异亮氨酸区分在过去Leu和Ile通常被认为无法被MS区分，因为它们的分子质量相同。在可变结构域中定位不正确的Leu/Ile残基，特别是在抗体的CDR（互补性决定区）中，可能导致抗原结合亲和力和抗体特异性的实质性丧失。

（4）亮氨酸和异亮氨酸在ETD碎裂条件下可以得到c/z离子，再辅助HCD碎裂，在z离子基础上脱掉一部分基团，形成w离子。亮氨酸脱掉丙基，形成43Da的丢失；异亮氨酸脱掉乙基，形成29Da的丢失。

（5）数据验证：分子量验证通过蛋白质分子量（完整，还原，脱糖，脱糖还原）可以获得蛋白质的基本修饰信息（氧化、脱酰胺、N端环化、C末端K缺失、糖基化修饰），从而验证De Novo得到的蛋白序列。De Novo测定得到的序列建立新的数据库，对采集到的质谱数据再次进行覆盖率分析，得到几乎匹配的结果。

泰克生物多年来致力于蛋白表达与测序研究。蛋白氨基酸序列分析是蛋白质研究的基础和关键。通过蛋白质测序获得的信息，拥有许多有价值的用途，如能够用于蛋白质的鉴定，分子克隆的探针设计，还可用作免疫原的肽段合成等。基于高分辨率质谱和高保真基因克隆技术，我们能够为客户提供高保真的的抗体和蛋白测序服务。