简介：

  BMSCs即为骨髓间充质干细胞，是骨髓中基质细胞，是骨髓的支持结构，并可作为滋养层支持骨髓中造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质干细胞。作为干细胞的一种，它同样具有多向分化潜能，在一定的环境和细胞因子的作用下，可被诱导分化为骨细胞、神经元样细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞等。其可被定义为具有多分化能力并且能自我更新复制的骨髓间质细胞。其各项优点，使得它在临床干细胞移植治疗中显示出极大的应用场景。目前已广泛使用在修复软骨损伤、神经细胞再生等领域。

材料与仪器:

• 烧杯、眼科剪、镊子、纱布、巴氏滴管、1ml注射器、血清、α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺/核苷）、PBS、60mm培养皿、T25培养瓶、15ml试管、双抗（青霉素、链霉素）D -hank’s液体

• 血清的保存方式：50ml离心管，分装冻存-20摄氏度

• 胰蛋白酶的保存方式：25%的胰酶，用的时候-4℃，不用放-20℃冻存

• 高温灭菌：高温袋子、灭菌指示带、烧杯、镊子

实验步骤：

(1)配置溶液：

• 50mL的10%培养基：44.5ml的基础培养基（现配现用）+5ml FBS（10%）+ 0.5ml双抗（1%）

• 10ml的2%FBS的培养基：9.7ml基础培养基+0.2ml FBS（2%）+0.1ml双抗（1%)

• 成品双抗（分装，20℃下冻存，用1ml离心管分装）

• 成品PBS：1×：50mlPBS=49.5mlPBS+0.5ml双抗（1ml冻存液）

• 2×：50mlPBS+49.00mlPBS+1ml双抗(冻存）

• 4个60mm培养基（分别装PBS*2、10%FBS的培养基*2/1.5ml）

• 15ml的试管

(2)具体操作：

1、将大鼠脱颈处死，放于装有酒精的烧杯中备用。给小鼠剥皮的过程可将小鼠置于盛有适量75%酒精的60mm培养皿中进行处理，个人建议每次单人操作不要超过2只小鼠，2只小鼠的细胞量已经足够，再多会延长提取时间这对细胞活性是个重大打击。

2、为避免细胞污染可将小鼠整个大腿分离后置于含有双倍双抗浓度PBS的60mm培养皿中暂存，待2只小鼠共四只大腿全部分离后在同一培养皿中用眼科剪及眼科镊分离股骨和胫骨表面的肌肉，我自己分离时喜欢先用剪刀剪开髌韧带之后顺着这个剪开的缝隙将大腿分成股骨和胫骨两段，然后将胫骨远端的几根肌腱用眼科有齿镊从骨头上剥离，之后夹住肌肉将其从骨头上撕下来，把那部分连着的腓骨也剪断然后剥下来只留一根胫骨，将这段骨头在另一个干净的含有1X双抗培养液的60mm培养皿中暂存。

3、待所有骨头表面肌肉清理干净后用剪刀剪开两端骨骺，注意暴露骨髓腔后的骨头不要再放回原来的培养皿，可再备另一个含有双抗培养液的培养皿用于暂时存放已经剪开骨骺的骨头（骨髓腔内为无菌环境，剪开后放回原培养皿可能导致污染和细胞损失)。

4、冲洗干净后将含有骨髓的培养皿中的细胞悬液收集到15ml离心管中用1ml移液枪反复吹打至无明显细胞团后离心去上清（这步也可以去除潜在的细菌，因为细菌较轻，如果细胞间无菌等级高个人认为可以跳过离心这步直接讲细胞悬液吹匀后放入培养箱内3h后换液）。

5、短时间内换液可以有效去除杂细胞，但为了防止干细胞的丢失个人建议在第一次换液时将换下的培养液接种到另一个新的培养皿中补加少量培养基放入孵箱内等待第一个8h后将2个培养皿同时换液。

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