在实验开始前，根据实验需求对小室的上下表面进行包被。在上室中接种细胞并加入处理因素，在下室中加入趋化因子。将上下室组合后放入Incucyte® 系统中，并对小室的上下表面进行连续成像。如上室接种的是悬浮细胞，其穿过8μm的半透膜直接进入下室，则上室检测到的细胞会逐渐减少。如上室接种的是贴壁细胞，其穿过半透膜后会黏附在小室的下表面，则下表面检测到的细胞随时间会增加。

CCR1是一种G 蛋白偶联受体（GPCR），表达于单核细胞、巨噬细胞、DCs、破骨细胞、T 淋巴细胞和中性粒细胞。CCR1能与MIP-1α,RANTES 和leukotactin-1等趋化因子结合后诱导免疫细胞的活化和迁移，因此BMS将其作为类风湿性关节炎（RA）的靶点，通过MIP-1α诱导的THP-1趋化实验筛选CCR1的抑制剂。

图3A展示了不同浓度的MIP-1α加入下室作用16h后诱导迁移的THP-1细胞的数量，结果呈现倒U型模式，其拟合的EC50值为0.2nM（相较于传统Boyden小室测得的EC50为0.1nM）。图3B采用1nM MIP-1α作为趋化因子，同时加入不同浓度的CCR1拮抗剂——化合物6，在较高浓度的化合物6条件下，小室上表面未迁移的THP-1细胞更多，说明化合物6抑制THP-1细胞的趋化。图3C比较了6个CCR1拮抗剂用Incucyte® 与传统Boyden小室趋化检测结果，显示出良好的一致性。

树突状细胞（DC）可以摄取和处理抗原、并转移至淋巴结将处理后的抗原递呈给初始T细胞，是最有效的抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells, APC）。研究表明iDC（未成熟细胞）表达CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4，而mDC（成熟细胞）则表达CCR7和CXCR4。

CCR1配体MIP-1α和CCR2配体MCP-1可以特异性诱导iDC细胞趋化，并且显示出明显的剂量依赖性（EC50分别为0.16nM和5.6nM，图4A和B），而对mDC无作用。CCR1抑制剂——化合物1特异性抑制MIP-1α（4nM）诱导的iDC趋化，CCR2抑制剂——化合物7特异性抑制MCP-1（20nM）诱导的iDC趋化（两者的IC50为1.3nM和1.1nM，图4C和D，对应传统Boyden小室检测结果是1.9nM和1.7nM）。

CXCR4的配体SDF-1α特异性诱导mDC细胞趋化（EC50为13nM，图4E），CXCR4特异性拮抗剂AMD3100的IC50为21nM(图4F).

乳腺癌是一种高转移性的常见癌症，在正常乳腺组织中，CXCR4的表达较低；然而在原发乳腺肿瘤和转移性乳腺癌里，CXCR4表达显著增高，且与患者预后差相关。研究表明，CXCR4配体SDF-1α确实特异性诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的趋化（EC50为22nM，图5A），CXCR4拮抗剂AMD3100抑制MDA-MB-231细胞的趋化（IC50为82nM，图5B）。

作为细胞免疫的重要组成部分，文章还研究了CXCR4配体SDF-1α对活化的T淋巴细胞和调节性T细胞Treg的趋化作用，对应的EC50分别为33nM和22nM（图6A和6C），CXCR4抑制剂AMD3100可以抑制两种细胞的趋化，对应的IC50为99nM和89nM（图6B和6D）。

以SDF-1α介导的人急性T淋巴细胞CCRF-CEM趋化为例，分别用Incucyte® 与传统Boyden小室方法定量检测10种CXCR4抑制剂对CCRF-CEM趋化的影响，将两种方法测得的IC50进行相关性分析，其相关系数R2为 0.8（图 7B）。在不同日期利用Incucyte® 进行两次独立的趋化测定，其相关系数R2值为0.85（图7C）。这均显示了Incucyte®趋化实验结果的良好重复性。

前面THP-1、DC、T细胞和贴壁肿瘤细胞检测的案例证明Incucyte® 趋化检测的应用广、结果可信且重复性好，可用于癌症转移和免疫招募等相关疾病的药物筛选中。虽然Incucyte® 趋化检测相比传统Boyden小室已实现实时检测和自动定量，但整个实验流程中仍涉及孔板包被、稀释、移液和孔板转移等手动操作步骤，基于此，BMS利用实验室自动化整合了一个高效的流程来建立自动趋化检测平台（图 8A）。以SDF-1α介导的Treg细胞趋化为例，8种CXCR4拮抗化合物自动和手动性检测的IC50具有良好的相关性（R2为0.88，Z’因子为0.6，图8B），说明该自动趋化检测平台的准确度和稳定性高。

除了文中提到的T 细胞（Treg细胞、活化的T细胞）、iDC 、mDC、THP-1和 MDA-MB-231 细胞，BMS公司还构建了包括B 细胞、mTh17、中性粒细胞、巨噬细胞、A549 和 NHLF细胞在内的多种细胞类型的Incucyte® 趋化检测模型。这些模型被广泛应用于免疫、肿瘤、心血管和纤维化相关的多个药物研发项目中。

-参考文献-

Chen J, Ribeiro B, Li H, Myer L, Chase P, Surti N, Lippy J, Zhang L, Cvijic ME. Leveraging the IncuCyte Technology for Higher-Throughput and Automated Chemotaxis Assays for Target Validation and Compound Characterization. SLAS Discov. 2018 Feb;23(2):122-131. doi: 10.1177/2472555217733437. Epub 2017 Sep 28. PMID: 28957636.