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Incucyte® 实时活细胞分析系统因其操作简便、可轻松进行实验设置和分析、以及能够直接放置于培养箱中进行自动拍摄而深受用户的喜爱，极大地解放了科研人员的劳动力。Incucyte® 能够精准计算各种细胞指标，在体外细胞水平的实验中有着广泛应用。
2023年全年，使用Incucyte® 发表CNS（Cell，Nature，Science三个顶尖杂志主刊）的数量就达到了26篇（文章列表见文末）！甚至在一个星期内出现了三篇Nature的壮举（一周3篇Nature：Incucyte上演科研帽子戏法！）。截止至今，应用Incucyte® 的文章总数已经超过了15,000篇！
今天陈老师就带大家一起来盘点一下这26篇CNS文章：
图1. 按照实验类型的应用统计
Incucyte® 的应用非常广泛，通过分析这些CNS文章可以发现，除了传统的细胞增殖、凋亡和划痕迁移实验外，它还被应用于细胞融合、病毒转染、病毒中和实验等应用。甚至有仅仅使用Incucyte®配套试剂的CNS文章出现[1]，由此可见，Incucyte®不仅仪器好用，其配套的试剂盒也很受欢迎。
图2.按研究方向分类
Incucyte® 在学术研究中的应用也很广泛，除了各种细胞治疗和药物研发项目，还涉及到基础医学研究等多个层面。值得一提的是，这些CNS文章中，也有国内学者（清华-北大生命科学联合中心）的贡献[2]。
接下来，就我们一起来看看其中几篇比较有特色的文章。
免疫抑制阻断治疗（ICB）的新机制！[3]
很多以PD1/PDL1为免疫检查点的抑制剂已被获批用于治疗具有错配修复缺陷（MMR-d）的癌症，这是一种精准的治疗方法。在MMR-d癌症中，常见到HLA基因的突变，这在理论上会阻止HLA依赖的CD8+T细胞识别并起到杀伤肿瘤细胞的作用，但是ICB依然有效果。本研究发现，除了CD8+T细胞，还存在第二道防线γδ T细胞（主要为Vδ1和Vδ3亚群）！γδ T 高表达PD-1和杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR），具有非HLA依赖途径的细胞杀伤毒性。
将不同MMR-d的CRC（直肠癌）病人的PD1+（Vδ1或Vδ3细胞）和PD1-γδ T细胞的杀伤能力进行比较，发现PD1+γδ T细胞杀伤能力明显强于PD1-。
Incucyte® 可以把长时间监测的图像生成视频，生成更直观的数据！
异种生物器官移植不是梦![4]
生物科技公司eGenesis发布了一项突破性的研究成果，蟹猴（cynomolgus macaque）在移植人源化猪肾后存活超过2年！人源化猪肾总共经过69处基因组编辑，包含敲除了被认为会引起免疫排斥的三个聚糖抗原（3KO），过表达7种人类转基因（7TG）以减少灵长类免疫系统的排斥反应，同时让猪逆转录病毒基因的所有拷贝失活（RI）。实验结果发现，携带人类转基因的供体肾脏移植到食蟹猴中后可显著延长存活时间。与接受仅敲除三聚糖抗原猪肾的对照组（3KO±RI）相比，那些接受含有敲除和人类转基因猪肾移植的食蟹猴（3KO.7TG±RI）存活时间延长了七倍多——两组的中位存活时间分别为24天和176天。在同时接受临床相关免疫移植方案、属于3KO.7TG±RI组中的一只食蟹猴，存活时间甚至超过2年（758天）。
在体外功能分析补体依赖性细胞毒性试验实验中，作者使用Incucyte® 活细胞分析系统和软件计算Cytotox red阳性细胞的数量。补体依赖细胞毒性是通过将Cytotox red阳性细胞的数量归一化到细胞总数来计算的。
图3. 当与人或食蟹猴血清孵育45分钟时，WT内皮细胞被溶解，而3KO（橙色组）修饰几乎完全消除了人血清的补体依赖性细胞毒性，但没有消除食蟹猴血清，这说明食蟹猴血清具有较强的抗猪细胞毒活性；当孵育时间延长至15h时，3KO修饰不足以完全保护细胞，即细胞被人血清杀死；3KO.7TG±RI（蓝色组）对人和食蟹猴血清细胞毒性均有保护作用，超过3KO的保护作用
即使是终点法，Incucyte® 强大的分析软件也可以派上用场，图片作为原始数据清晰度也足够。
胰腺癌新靶点 [5]
胰腺导管腺癌（PDA）因为有着局部浸润和转移扩散特征，是致死率最高的癌症之一，目前缺乏转移瘤特异相关的基因。本文分析了大量原发性和转移性PDA肿瘤的RNA剪接数据，检测到与RBFOX2基序高度相似的基序富集。在患者来源的异种移植物 （PDX）转移性PDA细胞系X50中，RBFOX2的过表达大大降低了这些细胞在体外和体内的转移潜力，而原发性胰腺肿瘤细胞系（BxPC3）中RBFOX2的耗竭增加了这些细胞的转移潜力，并揭示了RBFOX2作为PDA中转移抑制因子的作用,并提出了以RBFOX2为新靶点对转移性PDA的治疗方法。划痕伤口愈合实验是体外基因功能鉴定的重要手段，本文大量的此类实验是由Incucyte® 完成的。
图4. Incucyte® 划痕愈合实验测定：将每孔十万个细胞接种到Incucyte® ImageLock板上24小时后， 用Incucyte® 伤口制造工具（Incucyte® WoundMaker）制造划痕。以1小时的间隔成像24 h来监测细胞迁移；b图，过表达RBFOX2的X50细胞系的减少了迁移能力；e图，用CRISPR编辑RBFOX2后的BxPC3细胞系的迁移能力增强；h图，用CRISPR编辑RBFOX2一个外显子EIJ后的BxPC3细胞系的迁移能力增强，而过表达RBFOX2的BxPC3细胞系迁移能力减弱
Incucyte® 配备专门的划痕工具，并且从平均划痕宽度等方面来对划痕多维度追踪。每个实验组有3个独立实验和8个重复，本文的Incucyte® 相关图表数据超过10个，Incucyte® 可以一次监测6块板，实验组再多也不怕！
新冠病毒新受体发现[6]
已有研究通过CRISPR基因筛选技术发现TMEM106B是一种潜在的宿主受体，这是与大脑衰老有关的膜蛋白。比利时鲁汶大学科学家使用X射线晶体学、低温电子显微镜（cryo-EM）和氢氘交换质谱（HDX-MS）以及赛多利斯的Octet® 非标记分子互作系统和Incucyte® 实时活细胞分析系统等手段，从TMEM106B/S蛋白复合物结构解析角度进一步阐释了TMEM106B与新冠病毒结合的分子机理。
图5. Incucyte® 实时成像结果
细胞-细胞融合试验：ACE2或TMEM106B、S蛋白（带绿色荧光）转染HEK293T细胞，使其在表面表达这些蛋白，如果TMEM106B与S蛋白有结合，细胞可以融合形成更大的细胞团；左图：细胞融合成像；右图：每隔3个小时拍摄一次，计算>1000um2的对象的荧光面积总和，并做实时图谱；可见，转染ACE2或TMEM106B细胞可以融合，但是TMEM106B突变M210和F210后无法实现融合
图6. Octet® 数据：将TMEM106B固化在NTA传感器上，与13.5uM的S1蛋白结合解离。TMEM106B与S蛋白有着明显的结合，但是TMEM106B突变M210和F210位点后，就没有结合了，证实了复合物结构解析的结论。
Octet® 和Incucyte® ，一个从分子水平阐述，一个从细胞水平证明，是基础研究和药物研发的好帮手，两者结合1+1>2
总而言之，在上述研究中体现出Incucyte® 实时活细胞分析系统独特优势：
自动检测，提升实验效率：满足密集时间点以及长时间监测的需求，一次实验得到大量数据，解放人力，是从事细胞研究不可或缺的工具
分析简便，提升数据质量：软件采集及分析模块配合荧光检测试剂，得到高度可靠的数据。实时检测整个细胞死亡/凋亡曲线，在细胞死亡状况较为接近的情况下，仍然在大量数据的前提下得到确切的结论
6板位设计，多实验同步开展：内设6个板位，可以分别独立设置检测程序，满足6组不同实验或多人实验同时检测的需求
配套完整的试剂和工具，可以实现各种活细胞以及肿瘤球、类器官的长时间观察，以及趋化划痕迁移实验等
还是那句话，只要放好您的细胞，其他的交给Incucyte® 吧！
-参考文献-
[1] Hideko Isozaki.et al.(2023).Therapy-induced APOBEC3A drives evolution of persistent cancer cells.Nature.620,393-401
[2] Yanrong Zhuang.et al.(2023).Circadian clocks are modulated by compartmentalized oscillating translation.Cell.186(15),3245-3260
[3] Natasja L. de Vriesγ.et al.(2023).δ T cells are effectors of immunotherapy in cancers with HLA class I defects.Nature.613,743-750
[4] Amina Jbara.et al.(2023).RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer.Nature.617,147-153
[5] Amina Jbara.et al.(2023).RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer.Nature.617,147-153
[6] Jim Baggen.et al.(2023).TMEM106B is a receptor mediating ACE2-independent SARS-CoV-2 cell entry.Cell.186(16),3427-3442
- 2023年使用Incucyte® 发表CNS -
Ralf Schmidt.et al.(2023).Base-editing mutagenesis maps alleles to tune human T cell functions.Nature.
免疫细胞杀伤，细胞治疗
Mark Yarmarkovich.et al.(2023).Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs.Nature.
免疫细胞杀伤，细胞治疗
Stella Victorelli.et al.(2023).Apoptotic stress causes mtDNA release during senescence and drives the SASP.Nature.622, 627-636
细胞凋亡，衰老机制
Ranjith P. Anand.et al.(2023).Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation.Nature.622, 393-401
细胞毒性，器官移植
Christina K. Baumgartner.et al.(2023).The PTPN2/PTPN1 inhibitor ABBV-CLS-484 unleashes potent anti-tumour immunity.Nature.622,850-862
细胞毒性，肿瘤药物
Murad R. Mamedov.et al.(2023).CRISPR screens decode cancer cell pathways that trigger γδ T cell detection.Nature.621,188-195
免疫细胞杀伤，细胞治疗
Yogesh Goyal.et al.(2023).Diverse clonal fates emerge upon drug treatment of homogeneous cancer cells.Nature.620,651-659
细胞增殖，肿瘤机制
Hideko Isozaki.et al.(2023).Therapy-induced APOBEC3A drives evolution of persistent cancer cells.Nature.620,393-401
细胞标记（试剂），肿瘤机制
Jiexi Li.et al.(2023).Histone demethylase KDM5D upregulation drives sex differences in colon cancer.Nature.619,632-639
细胞增殖，肿瘤机制
Nobuhiko Kayagakiet al.(2023)..Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury.Nature.618,1072-1077
细胞转染，创伤治疗
Guoxun Wang.et al.(2023).Norovirus MLKL-like protein initiates cell death to induce viral egress.Nature.616,152-158
细胞凋亡，病原菌侵染机制
Amina Jbara.et al.(2023).RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer.Nature.617,147-153
划痕迁移，肿瘤机制
Aidan M. Tousley.et al.(2023).Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells.Nature.615,507-516
免疫细胞杀伤，细胞治疗
Cristina Puig-Saus.et al.(2023).Neoantigen-targeted CD8+ T cell responses with PD-1 blockade therapy.Nature.615,697-704
免疫细胞杀伤，免疫治疗
Joe Nassour.et al.(2023).Telomere-to-mitochondria signalling by ZBP1 mediates replicative crisis.Nature.614,767-773
细胞凋亡，衰老机制
Natasja L. de Vriesγ.et al.(2023).δ T cells are effectors of immunotherapy in cancers with HLA class I defects.Nature.613,743-750
免疫细胞杀伤，免疫治疗
Nora Schmidt.et al.(2023).SND1 binds SARS-CoV-2 negative-sense RNA and promotes viral RNA synthesis through NSP9.Cell.186(22),4834-4850
病毒侵染，病原菌侵染机制
Franziska Blaeschke.et al.(2023).Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies.Cell.186(19),4216-4234
免疫细胞杀伤，细胞治疗
Jim Baggen.et al.(2023).TMEM106B is a receptor mediating ACE2-independent SARS-CoV-2 cell entry.Cell.186(16),3427-3442
细胞融合实验，病原菌侵染机制
Yanrong Zhuang.et al.(2023).Circadian clocks are modulated by compartmentalized oscillating translation.Cell.186(15),3245-3260
细胞增殖，昼夜调控机理
Balamurugan Sundaram.et al.(2023).NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs.Cell.186(13),2783-2801
细胞凋亡，焦亡机理
Christina M. Arieta.et al.(2023).The T-cell-directed vaccine BNT162b4 encoding conserved non-spike antigens protects animals from severe SARS-CoV-2 infection.Cell.186(11), 2392-2409
病毒中和实验，疫苗
Stephen P. Burr.et al.(2023).Cell lineage-specific mitochondrial resilience during mammalian organogenesis.Cell.186(6),1212-1229
细胞增殖，器官发育
William A. Nyberg（2023）.An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells.Cell.186(2), 446-460
免疫细胞杀伤，基因治疗
PABLO RODRÍGUEZ-SILVESTRE.et al.(2023).Perforin-2 is a pore-forming effector of endocytic escape in cross-presenting dendritic cells.SCIENCE.380(6651)
细胞增殖，免疫机制
PHONG D. NGUYEN.et al.(2023).Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration.SCIENCE.380(6646)
细胞增殖，心脏再生
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