在微生物研究，尤其是细菌学中，对菌体计数是一项最基本的需求。常规的计数方法主要是国家标准推荐的平板计数法和显微镜计数法，但它们耗时长、误差大，且平板法只能计数活菌。

近年来，随着荧光染料、结构光学和流式细胞仪技术的不断发展，流式细胞术检测细菌等微生物成为可能。与传统检测方法相比，其具有灵敏、快速、高效、精确的优势，流式细胞术已经成为微生物研究中的一个重要工具，在单细胞层面对细菌结构和功能的多项参数进行更深层的分析，以研究细菌的异质性和鉴定细菌种属。

本方案以大肠杆菌为例，介绍层浪流式细胞仪如何评估活菌比例和计数。

——实验背景——

膜的完整性评估是细菌活力的重要评价手段，通常使用膜渗透性和非渗透性荧光染料来进行活力测试，目前比较常见的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作为一种可渗透的绿色荧光核酸染料，被动扩散进入细胞内，既可以进入细胞膜完整的细菌中，也可以进入细胞膜受损的细菌中，与核酸染料结合。而红色荧光核酸染料PI只能进入不完整细胞膜的细菌中。当SYTO 9和PI同时加的时候，PI染料进入膜内，会导致SYTO 9荧光染料的降低。因此，具有完整细胞膜的细菌呈现绿色，而膜不完整的细菌呈现红色。


图1：SYTO 9/PI细菌活力测定法原理示意图

——样本处理——

1. 收集对数生长期的大肠杆菌，10000g，5min，离心洗涤，取细胞沉淀重悬于0.22um过滤的无菌PBS中；

2.进行细菌计数，为后续染色做准备；

3. 取4个流式管，标记为空白组，SYTO 9和PI单染组，样本组。每个试管加100ul细菌悬液，保证细菌数在10⁶-10⁷左右。

——样本染色——

1. 根据厂家试剂盒建议，单染组分别加1ul SYTO 9或1ul PI，样本组加1ul SYTO 9和1ul PI，加PBS至988ul。涡旋，室温避光孵育15min；

2. 充分涡旋微球，每管分别加10ul，每份样本中体系为1000ul；

3. 设置参数，用层浪FongCyte流式细胞仪采集信号，SYTO 9（Max Ex/Em=485/498nm）用FITC通道检测，PI（Max Ex/Em=535/617nm）用PerCP通道检测，两个通道光谱重叠小，补偿易调节。

——数据分析——

1. 细菌比较小，选择对数模式分析。设置合适的电压，使细菌群信号在流式图中间清晰地呈现。设置合适的阈值，很大程度减少背景噪音。此实验中，设置的是FSC和FITC双阈值；

2. 根据FSC和SSC，圈出主细菌，右上角的一群是微球（图2）；

3. 从主细菌中，选择SYTO 9和PI，红光区域的代表死菌，绿光区域的代表活菌（图3）。

——总结——

1. 原核生物平均直径在1um左右，需要挑选合适的流式细胞仪。层浪的流式细胞仪检测直径在0.1-50um，除大肠杆菌外，还可以检测葡萄球菌、酵母、浮游生物、益生菌等；

2. 层浪流式细胞仪可以获得体积法绝dui计数，跟微球法结果有较高的一致性，节约实验经费；

3. 细菌活力染色实验对管路的洁净度要求高，层浪流式细胞仪每管样本间采样针自动清洗，携带污染率为0.05%，能够获得更加准确的结果。

数据来源 : 广州某实验室

层浪： 您好，可以采访下您近期使用层浪流式细胞仪的感受吗？

客户： 可以的。

层浪：  在层浪的仪器上，您们日常都做哪些样本？

客户：  我们实验室开展多种流式实验，在微生物方面，除了细菌，还做酵母、益生菌检测等。

层浪：  您对于层浪的仪器，有哪些使用感受和反馈吗？

客户：  我们之前用平板法培养细菌进行计数，这种方式只能培养活菌，通常耗时3天左右，而流式细胞术对活菌和死菌都可以计数，比平板法的计数结果会高一些，更准确一些，而且灵敏、检测速度快、时间短，极大地提高了我们出数据的效率，我们现在逐渐用流式替代平板法了。

层浪：  确实，现在流式细胞仪在微生物研究中的作用越来越广泛了。

客户：  我们实验室之前有一款进口的流式细胞仪，现在使用贵司的仪器，非常喜欢您们的软件！中文的界面，功能键直观，而且操作简单。细菌实验对仪器的清洁度要求高，还要避免管路之间的交叉污染，之前我们是上完一个样本，再上一管水，进行反冲。而您们的仪器每个样本之间能够进行采样针清洗，免去了我们每管样本手动清洗的麻烦。做普通清洗和深度清洗也很方便，使用的清洗液用量也不大。

层浪：  非常感谢您的反馈。层浪会继续努力，用心服务每一位客户。


图4：层浪生物FongCyte™3光14色流式细胞仪

参考文献：

1、刘新星,霍转转.流式细胞术在细菌快速检测中的应用；微生物学通报。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、邓颖,基于流式细胞术的SYTO 9/PI细菌活性判定方法优化及其机理;暨南大学硕士学位论文.

3、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

5、Martin G. Wilkinson,Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review.//doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.006.