siRNA转染的常见问题解答

                                          siRNA转染的常见问题解答

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如何优化siRNA转染？转染少量的siRNA为何很重要？在siRNA转染过程中为何应当避免细胞毒性？本文收录了与siRNA转染相关的常见问题，并附上专家的解答，希望能对您的实验有帮助。

Q：我该如何优化siRNA转染？

A：在实验室中建立RNAi和研究每一种新的细胞系时，应当优化siRNA的转染。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含优化的有用信息（www.qiagen.com/HB/HiPerFect）。在优化实验中，转染效率可通过阳性对照（如AllStars Cell Death Control siRNA）的转染来监控。应当优化的转染因素包括：
试剂和siRNA的量

转染时的细胞汇合度

分析前细胞和复合物的孵育时间

Q：转染少量的siRNA为何很重要？

A：高浓度的siRNA转染可能产生脱靶效应，即siRNA影响了部分同源或非同源基因的表达。研究表明，可能会对RNAi实验产生误导结果的脱靶效应可通过降低siRNA浓度而在很大程度上避免（1,2）。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的吸收，实现了低浓度下的基因沉默，而不损害knockdown的效率。

Q：在siRNA转染过程中为何应当避免细胞毒性？

A：siRNA导入所引起的细胞毒性干扰了RNAi后的数据分析，因为表型分析不再可靠。影响数据分析的因素包括转染试剂所引起的表型改变，压力所引起的基因表达改变，以及不应当用于分析的死细胞的存在。

HiPerFect Transfection Reagent对细胞无毒性，不会引起液泡形成（这标志着细胞进程的破坏）。详细的细胞周期和细胞形态学分析显示mock转染的细胞（只有HiPerFect Transfection Reagent）和未转染的细胞之间无差异。

Q：顺式转染和反式转染之间有什么差别？

A：在反式转染的步骤中，siRNA先加在平板的孔中，然后才是转染试剂。在复合物形成之后，加入细胞。顺式转染则相反，先在孔中加入细胞，然后才是复合物。反式转染使用广泛，特别对于高通量实验，因为它容易自动化，转染前siRNA可储存在孔中，且使用了较少的材料，因为不需要在一块单独的板上开展siRNA-转染试剂复合物的形成。

顺式转染                                       反式转染
第1步 细胞                                   第1步 核酸
第2步 转染复合物                       第2步 HiPerFect Reagent
                                                        第3步 细胞

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